miR-26對TGF-β2誘導的人Tenon氏囊成纖維細胞遷移、細胞外基質蛋白表達的調控作用及其機制

李燕，孟凱，杜允宏，陳斐，劉文靜，鮑慧婧

1青島大學附屬泰安市中心醫院眼科，山東泰安 271000；

2青島大學附屬泰安市中心醫院肛腸外科

青光眼濾過性手術是目前治療青光眼尤其是終末期青光眼的主要手段，但該手術方式存在較高的遠期失敗率，手術區濾過泡瘢痕形成是導致青光眼濾過性手術失敗的主要原因［1］。轉化生長因子β2（TGF-β2）是創傷后組織修復過程中關鍵的調控分子，可通過介導人Tenon氏囊成纖維細胞（HTFs）增殖、遷移并分泌大量細胞外基質，促進細胞纖維化進程，加速青光眼術后濾過泡瘢痕化，從而造成手術失敗。miR-26是微小RNA（miRNA）的一種，位于人3號染色體3P21.3，由21～23個核苷酸組成，被證實能夠影響多種腫瘤的發生發展［2-4］。近年來多項研究表明，miR-26在肝臟纖維化、心肌細胞纖維化、腎臟纖維化以及晶狀體纖維化等多種纖維化疾病中發揮重要調控作用，已經成為進一步開發抗纖維增生藥物的新靶點［5-8］。但是，目前關于miR-26在青光眼術后濾過泡瘢痕化中的研究比較少。2018年9月—2021年12月，本研究觀察了miR-26對TGF-β2誘導后HTFs細胞遷移及細胞外基質（ECM）蛋白分泌的影響，并對其可能的作用機制進行探討，為青光眼術后抗瘢痕化治療提供新的靶點和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料DMEM陪養基、胎牛血清均購自美國Gibco公司，青—鏈霉素雙抗購自美國Hyclone公司，胰蛋白酶購自上海實生生物技術有限公司，Lipo?fectamineTM2000試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒、qPCR試劑盒均購自大連寶生物科技有限公司，TGF-β2購自美國R&D Systems公司；角蛋白一抗、波形蛋白一抗、FITC熒光二抗、纖維連接蛋白（Fibronectin）一抗、Ⅰ型膠原蛋白（COLⅠ）一抗、CTGF一抗 均購 自美 國Santa Cruz公 司。miR-26的模擬物和2'甲氧基修飾的反義寡核苷酸序列根據Elbashir的設計原則進行設計，由上海吉瑪制藥有限公司合成，經BLAST查詢，排除與其他基因同源。

1.2 HTFs的提取、培養及鑒定

1.2.1 HTFs的提取選擇2018年9月—2021年10月于本院行青光眼濾過性手術的青光眼患者10例，平均年齡50.12歲，男女比例為4∶6。術中沿患者角鞏緣剪開球結膜，取結膜下適當體積的Tenon氏囊組織，注意避免混入結膜上皮組織，置于無菌的生理鹽水瓶中保存。本研究通過醫院倫理委員會審核，患者均簽署知情同意書。

1.2.2 HTFs的原代培養將無菌取材的Tenon氏囊組織置于培養皿中，PBS反復沖洗，加入少量含20%胎牛血清的DMEM培養液；用眼科剪將其剪成大小約0.5 mm3的組織塊，置于35 mm2培養皿中，接種后加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于恒溫培養箱中培養。每天換液1次，組織塊貼壁培養3～8 d后，倒置顯微鏡下可見細胞從組織邊緣游離出，細胞形態不一，多呈長梭形、多邊形或星狀，可有2～5個細長狀突起，細胞核大而居中；20 d左右細胞生長漸漸達融合狀態。倒置顯微鏡下觀察當細胞融合達到90%時，即可進行傳代培養，細胞傳代3次后，細胞生長趨于一致，細胞呈長梭形，大小不一，呈旋渦狀或魚群樣分布，有一定的方向性；細胞體透亮，細胞核位于細胞中央，呈橢圓形，符合HTFs的形態學特征，見OSID碼圖1。

1.2.3 HTFs表型鑒定采用免疫熒光染色。取傳至第4代的HTFs進行后續實驗，6孔板中加入培養液，放入爬片，以4×104/mL進行接種，培養48 h后取出爬片，每孔加入PBS 1～2 mL漂洗3次；吸除PBS，用乙醇與冰醋酸（99∶1）的混合液固定細胞15 min，PBS漂洗。加入0.5% Triton X-100 1 mL，室溫下孵育10 min，PBS漂洗；加入10%羊血清1 mL，室溫下封閉30 min，吸除羊血清。滴加0.5%BSA稀釋的單克隆兔抗人波形蛋白、角蛋白一抗（稀釋比例均為1∶100），置于4℃濕盒孵育過夜，PBS漂洗；滴加FITC標記的0.5%BSA稀釋二抗，室溫孵育1 h，PBS漂洗。加入碘化丙啶（PI），37℃孵育10 min，封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。免疫熒光染色結果顯示，波形蛋白在HTFs細胞質內呈陽性表達，表現為與細胞生長方向一致的束狀綠色高熒光，角蛋白在HTFs細胞質內呈陰性表達，見OSID碼圖2；證實培養的細胞為成纖維細胞。

1.3 細胞分組及處理方法取對數期傳代的HT?Fs，調整細胞密度為4×104/mL，每孔板2 mL接種到6孔板。將細胞隨機分為空白組（不予轉染）、TGFβ2組（不予轉染）、TGF-β2+miR-26 mimics組（轉染miR-26類似物）、TGF-β2+mimics NC組（轉染miR-26陰性對照物）、TGF-β2+miR-26 inhibitors組（轉染miR-26抑制物）、TGF-β2+inhibitors NC組（轉染miR-26抑制物陰性對照物），按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書進行操作；轉染24 h后，空白組加入等體積含10%FBS的DMEM培養基，其余各組更換為含5 μg/L TGF-β2及10%FBS的DMEM培養基，培養48 h進行后續檢測。

1.4 細胞遷移能力觀察采用劃痕實驗。取各組細胞，吸除培養基，用200 μL無菌槍頭在融合的細胞層上沿直尺作一劃痕，PBS沖洗，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中，培養48 h后將細胞置于倒置顯微鏡下拍照。采用Image J軟件測量劃痕寬度，細胞遷移率=（初始劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。

1.5 細胞COLⅠ、Fibronectin蛋白檢測采用Western blotting法。取各組細胞，使用RIPA試劑提取總蛋白，BCA法定量。加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃恒溫水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白40 μg行SDS?PAGE電泳，轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。分別加入COLⅠ、Fibronectin、GAP?DH一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過夜；加入二抗（稀釋比例均為1∶1 000），室溫條件孵育1 h。采用Odyssey紅外圖像成像系統掃描成像，以GAPDH為內參，計算COLⅠ、Fibronectin蛋白相對表達量。

1.6 miR-26和CTGF的靶向作用觀察采用生物信息學軟件Target Scan篩選發現，CTGF基因下游的3′非翻譯區存在miR-26的結合位點（見圖1）。采用熒光素酶報告基因實驗進行驗證，CTGF的野生型（WT）和突變型（MUT）3'-UTR均由上海吉瑪制藥有限公司克隆到報告基因監測系統pmiR-RBReportTM質粒載體中。取對數期傳代的HTFs，分為四部分，分別共轉染WT-CTGF、MUT-CTGF 100 ng與miR-26 mimics、miR-26 NC載體50 nmol/L，嚴格按照LipofectamineTM2000說明書進行操作，共轉染48 h后按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書操作，記錄海腎熒光素酶與螢火蟲螢光素酶的熒光值，以二者的比值表示熒光素酶相對活性。共轉染miR-26 mimics+WT-CTGF的HTFs熒光素酶相對活性明顯低于共轉染miR-26 NC+WT-CTGF的HTFs（P<0.05），共 轉 染miR-26 mimics+MUT-CTGF的HTFs與 共 轉 染miR-26 NC+MUT-CTGF的HTFs熒光素酶相對活性比較差異無統計學意義（P>0.05）。

圖1 Target Scan軟件顯示miR-26和CTGF存在結合位點

1.7 各組細胞CTGF mRNA及蛋白檢測①CTGF mRNA：采用實時熒光定量PCR法。取各組細胞，采用TRIzol法提取總RNA，行逆轉錄反應。CTGF引物序列：上游引物5′-GCGGCTTACCGACTGGA-3′、下 游 引 物5′-AGGCGGCTCTGCTTCTC-3′，內 參GAPDH引 物 序 列：上 游 引 物5′-GTCGATGGC?TAGTCGTAGCATCGAT-3′、下 游 引 物5′-TGC?TAGCTGGCATGCCCGATCGAT-3′。PCR反應體系：模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Master 12.5 μL，加雙蒸水補充至25 μL。PCR反應過程：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火、延伸60 s，共40個循環，最后72℃延伸3 min。PCR完成后，采用2－ΔΔCt法計算CTGF mRNA相對表達量。②CTGF蛋白：參照1.5采用Western blotting法檢測各組細胞CTGF蛋白相對表達量。

1.8 CTGF、miR-26共同作用對TGF-β2誘導的HTFs細胞遷移及COLⅠ、Fibronectin蛋白表達影響的觀察

1.8.1 細胞分組處理參照Gen Bank數據庫提供的CTGF基因序列，由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成CTGF-siRNA和陰性對照siRNA。將對數生長期的HTFs分為空白轉染組（不予轉染）、miR-26 inhibitor組（轉染miR-26 inhibitor）、miR-26 inhibi?tors+si-NC組（轉 染miR-26 inhibitor+陰 性 對 照siRNA）、miR-26 inhibitors+si-CTGF組（轉染miR-26 inhibitor+CTGF-siRNA），嚴格按照LipofectamineTM2000說明書操作；轉染24 h后，空白轉染組加入等體積含10%FBS的DMEM培養基，其余各組更換為含5 μg/L TGF-β2及10%FBS的DMEM培養基，培養48 h進行后續檢測。

1.8.2 細胞遷移能力參照“1.4”采用劃痕實驗檢測各組細胞遷移率。

1.8.3 細胞COLⅠ、Fibronectin蛋白表達參照“1.5”采用Western blotting法檢測各組細胞COLⅠ、Fibronectin蛋白相對表達量。

1.9 統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk正態性檢驗，呈正態分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 六組細胞遷移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白表達比較空白組、TGF-β2+miR-26 mimics組

表1 六組細胞遷移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白相對表達量比較（±s）

表1 六組細胞遷移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白相對表達量比較（±s）

注：與空白組、TGF-β2+miR-26 mimics組比較，*P<0.05；與TGF-β2組、TGF-β2+mimics NC組、TGF-β2+inhibitors NC組比較，#P<0.05。

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2.2 六組細胞CTGF mRNA和蛋白表達比較CT?GF mRNA相對表達量：空白組

表2 六組細胞CTGF mRNA和蛋白相對表達量比較（±s）

表2 六組細胞CTGF mRNA和蛋白相對表達量比較（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與TGF-β2組、TGF-β2+mimics NC組、TGF-β2+inhibitors NC組比較，#P<0.05。

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2.3 四組細胞遷移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白表達比較TGF-β2+miR-26 inhibitors+si-CTGF組<空白 轉染 組

表3 四組細胞遷移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白相對表達量比較（±s）

表3 四組細胞遷移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白相對表達量比較（±s）

注：與空白轉染組比較，*P<0.05；與TGF-β2+miR-26 inhibitors組、TGF-β2+miR-26 inhibitors+si-NC組比較，#P<0.05。

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3 討論

青光眼濾過性手術后瘢痕過度增生導致的濾過泡包裹是青光手術失敗的主要原因，目前臨床上通常采用的5-FU、MMC、環孢霉素A（CsA）等均是通過抑制成纖維細胞增殖而發揮作用，取得了一定療效，但是由于這些藥物對眼部組織的作用具有非特異性，常常導致濾過泡滲漏、低眼壓性黃斑病變等一系列并發癥的發生。因此，闡明青光眼術后濾過通道瘢痕化的機制，并積極探索特異性更強、更安全有效的新靶點一直是眼科青光眼領域研究的熱點。

TGF-β2是創傷后組織修復過程中關鍵的調控分子，與青光眼術后濾過泡瘢痕形成關系密切，主要通過介導HTFs細胞增殖、遷移并分泌大量細胞外基質以促進細胞纖維化進程。過去曾認為，抗TGF抗體是青光眼術后抗纖維化治療的方法之一，有多項研究嘗試通過阻斷TGF-β2表達來有效抑制濾過泡瘢痕，從而提高手術成功率，如ilomastat、Decorin、ASON等。但事實證實這種方法具有雙刃劍的作用，阻斷TGF在緩解了其促纖維化效應的同時，也抑制了其正面的抗炎效應。因此，臨床亟需尋找一種靶向作用更強、療效更高、不良反應更小的藥物用于抑制青光眼濾過性手術后瘢痕的形成。

miRNA是真核生物體內的一類長22～24個核苷酸的單鏈小分子RNA，是非編碼RNA的一種，具有高度的基因保守性。miRNA對基因表達的調控位于轉錄后水平，通過完全或者不完全互補配對，特異性結合到靶mRNA的3′非翻譯區，引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制，從而抑制靶蛋白表達。近年多項研究表明，miRNA與青光眼的發病、進展有關［9-12］。miR-26作為miRNA的一種，最早被發現在多種腫瘤的發生和轉移方面具有重要作用，近年來越多的研究證實miR-26在多種器官纖維化過程中發揮重要作用。ZHANG等［7］研究發現，在單側輸尿管梗阻（UUO）小鼠的腎臟、肌肉和外泌體中，miR-26a表達減少，小鼠骨骼肌注射miR-26a可減弱UUO小鼠的腎纖維化。CHEN等［8］研究認為，miR-26a和miR-26b在體內外均能顯著抑制晶狀體上皮細胞的增殖、遷移和晶狀體纖維化。但是，關于miR-26在青光眼術后濾過通道瘢痕化過程中的作用目前尚無相關研究。

成纖維細胞向創面的遷移移行是創面愈合的重要步驟，而細胞外基質蛋白的過量分泌和合成是創傷后瘢痕形成的關鍵因素。本研究通過檢測COLⅠ和Fibronectin蛋白表達來評價miR-26對ECM蛋白分泌的影響；結果顯示，與對照組比較，TGF-β2組細胞遷移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白表達均升高，提示TGF-β2可誘導HTFs細胞遷移及ECM蛋白分泌；與TGF-β2組比較，miR-26 mimics組COLⅠ和Fibronectin蛋白表達下降，miR-26 inhibitors組COLⅠ和Fibronectin蛋白表達提高，提示miR-26能抑制TGF-β2誘導的ECM蛋白分泌，而敲低miR-26可以促進ECM分泌。KOGA等［13］研究表明，在糖尿病腎病模型中，miR-26可以抑制TGF-β誘導的ECM蛋白表達，與本研究結果一致。

目前已有多項研究表明，miR-26的抗纖維化作用是通過抑制CTGF表達而實現的。YANO等［14］研究發現，細胞暴露于電離輻射后，miR-26a表達下調，miR-26a在轉錄后水平負向調控CTGF表達，可減輕輻射后引起的纖維化作用。LI等［15］研究發現，miR-26a-5p過表達可通過降低支氣管肺泡灌洗液中總蛋白、中性粒細胞、淋巴細胞計數以及腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、丙二醛（MDA）和髓過氧化物酶（MPO）表達，緩解脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠的炎癥反應，而CTGF過表達可以逆轉miR-26a-5p對細胞凋亡和炎癥反應的影響。本研究采用生物信息學軟件Target Scan對CT?GF基因的3′非翻譯區進行了潛在靶點的篩選，發現CTGF基因下游的3′非翻譯區存在miR-26的結合位點，此結合位點位于人CTGF基因mRNA的3′非翻譯區652～659 bp處；雙熒光素酶報告基因實驗也證實miR-26可與CTGF靶向結合，證實CTGF是miR-26的下游靶點。本研究結果顯示，miR-26過表達后HTFs中的CTGF蛋白表達降低，抑制miR-26表達后細胞內CTGF蛋白表達增高，但miR-26過表達/抑制對細胞CTGF mRNA表達無明顯影響。由此我們推測，miR-26可能在轉錄后水平直接靶向結合CTGF mRNA而負調控CTGF蛋白表達。本研究在轉染miR-26 inhibitors質粒的基礎上采用RNA干擾技術抑制細胞內CTGF基因表達，結果發現與TGF-β2+miR-26 inhibitors組比較，TGF-β2+miR-26 inhibitors+si-CTGF組細胞遷移能力以及促ECM蛋白分泌能力降低，表明敲除CTGF基因能夠逆轉miR-26下調對TGF-β2誘導的HTFs細胞遷移和ECM蛋白表達的影響。

綜 上 所 述，miR-26可 以 抑 制TGF-β2誘 導 后HFTs細胞遷移及ECM蛋白合成，該作用可能是通過轉錄后水平靶向CTGF來實現的，調控miR-26表達有望為青光眼術后抗瘢痕化治療提供新的思路。