李莎莎，劉曉茜，黃靜，杜林娜，賈盼攀，李露

西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，西安 710077

腎缺血/再灌注（I/R）損傷是導(dǎo)致急性腎損傷（AKI）發(fā)病和患者死亡的重要因素，目前仍沒(méi)有有效的治療方法［1］。自噬是一種高度保守的真核細(xì)胞再循環(huán)過(guò)程，可誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)成分在溶酶體中被吞噬和降解［2］。自噬被認(rèn)為在缺血、缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏、遺傳毒性、感染、未折疊蛋白反應(yīng)等應(yīng)激條件下被高度誘導(dǎo)，以上這些均參與了腎I/R損傷的發(fā)病過(guò)程［3］。然而，目前自噬在腎I/R損傷中發(fā)揮保護(hù)性還是破壞性的作用仍然存在爭(zhēng)議。研究發(fā)現(xiàn)，miR-145-5p在心肌和腦組織缺血/再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［4-5］。本課題組前期研究證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體將miR?145?5p傳遞到腎細(xì)胞，并通過(guò)減輕氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕了腎I/R損傷。但目前miR?145?5p能否通過(guò)改變腎組織的自噬水平而減輕腎I/R損傷尚不清楚，且其分子機(jī)制亦需進(jìn)一步探究。2022年3月—8月，本研究觀察了miR-145-5p過(guò)表達(dá)對(duì)腎I/R損傷大鼠的腎臟保護(hù)作用，并探討其機(jī)制是否與調(diào)控自噬和其他信號(hào)通路激活有關(guān)，為臨床以miR-145-5p為靶點(diǎn)治療腎I/R損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，10～12周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（陜）2019-001。主要試劑：血尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司，逆轉(zhuǎn)錄TaqMan miRNA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，AKT特異性抑制劑LY294002購(gòu)自美國(guó)GlpBio公司；促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2，蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（AKT/mTOR）信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR），自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈（LC3）、肌球蛋白樣Bcl-2結(jié)合蛋白（Beclin1）、自噬相關(guān)蛋白5（Atg5）和內(nèi)參β-ac?tin抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；miR-145-5p agomir購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及處理將40只SD大鼠隨機(jī)分成Sham組、I/R組、I/R+agomir組、I/R+agomir+LY組，每組10只。除Sham組外均建立腎臟I/R損傷模型：腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg進(jìn)行麻醉，腹腔注射肝素鈉500 U，開(kāi)腹后游離雙側(cè)腎臟，切除右腎，夾閉左腎動(dòng)、靜脈60 min后開(kāi)放，逐層縫合腹壁；Sham組僅給予切開(kāi)及關(guān)閉腹腔操作，不予血管夾閉。I/R+agomir組和I/R+agomir+LY組在I/R操作前3 d經(jīng)尾靜脈注射miR-145-5p agomir 10 nmol/L，I/R+agomir+LY組同時(shí)腹腔注射LY294002 50 mg/kg，Sham組和I/R組經(jīng)尾靜脈注射等量PBS溶液。各組分組處理2 d后用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，心臟穿刺采血處死。4%多聚甲醛固定液經(jīng)心臟進(jìn)行全身灌注，待腎臟顏色消退后立即取出腎臟，將右腎組織快速放入1.5 mL冷凍管中，液氮保存；左腎組織沿長(zhǎng)軸縱向切開(kāi)，4%多聚甲醛固定。

1.3 腎組織miR-145-5p檢測(cè)采用qRT-PCR法。取各組液氮保存的右腎組織，RNA提取試劑盒提取總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR引物序列：miR-145-5p上游引物5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3′、下 游 引 物5′-GCTGTCAACATACGCTACGTAACG-3′，內(nèi)參U6上游引物5′-TAAAATCTATACACGAC?GGCTTCG-3′、下 游 引 物5′-TACTGTGCGTTTA?AGCACTTCGC-3′。使用TaqMan miRNAs檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94℃30 s，94℃5 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-145-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.4 腎功能檢測(cè)收集各組大鼠的血樣，4℃條件下3 000 r/min離心20 min，收集上清。按照BUN、Scr試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)血清BUN、Scr水平。

1.5 腎組織病理觀察采用HE染色。取各組4%多聚甲醛固定的左腎組織，4 μm厚度切片。將石蠟切片在100%二甲苯和二甲苯與乙醇（比例為1∶1）的混合溶液中浸泡15 min，脫蠟，分別在100%、95%和75%乙醇中浸泡1 min，生理鹽水清洗。蘇木精染色30 min，加入伊紅復(fù)染，光鏡下觀察腎組織病理變化。對(duì)腎組織損傷情況進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分為0～4分，分?jǐn)?shù)越高提示腎組織損傷越嚴(yán)重［6］。

1.6 腎組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用TUNEL法。取各組腎組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟水合后用PBS液小心振蕩洗滌，用0.1% Triton X-100打孔5 min。按照TUNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，將1號(hào)和2號(hào)液按照1∶9的比例混合配制，37℃避光孵育1 h后，PBS液振蕩洗滌3遍。DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，37℃避光孵育5 min。激光掃描共聚焦顯微鏡照像，以發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)占藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)的百分比計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.7 腎組織LC3B檢測(cè)采用免疫熒光法。取各組腎組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟水合后用PBS液小心振蕩洗滌，0.1% Triton X-100打孔5 min。按照LC3B抗體試劑盒說(shuō)明書(shū)，將LC3B和PBS液按照1∶200的比例混合配制，4℃避光孵育12 h，PBS液振蕩洗滌3遍；將熒光二抗和PBS液按照1∶300的比例混合配制，37℃避光孵育2 h，PBS液振蕩洗滌3遍。DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，37℃避光孵育5 min。激光掃描共聚焦顯微鏡照像，采用Image J軟件分析LC3B免疫熒光強(qiáng)度。

1.8 腎組織AKT/mTOR信號(hào)通路及凋亡、自噬相關(guān)蛋白檢測(cè)采用Western blotting法。取各組液氮保存的右腎組織，研磨后提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行蛋白定量。將蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、Bax、Bcl-2、LC3B、Be?clin1、Atg5（稀釋比例均為1∶1 000）和β-actin（稀釋比例為1∶2 000）一抗，4℃孵育過(guò)夜；TBST洗脫3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗（稀釋比例均為1∶5 000），室溫孵育2 h；TBST洗脫3次，通過(guò)Bio-Rad照相系統(tǒng)采集照片，采用ImageLab軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算p-AKT/AKT、pmTOR/mTOR及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織miR-145-5p表達(dá)比較Sham組、I/R組、I/R+agomir組、I/R+agomir+LY組腎組織miR-145-5p相對(duì)表達(dá)量分別為1.04±0.14、0.46±0.15、1.51±0.18、1.46±0.14；與Sham比較，I/R組miR-145-5p表達(dá)明顯降低，I/R+agomir組和I/R+agomir+LY組均明顯升高（P均<0.01）。

2.2 各組大鼠腎功能指標(biāo)及腎組織損傷評(píng)分比較與Sham組相比，I/R組及I/R+agomir+LY組腎組織切片示腎小球壞死和肥大，小管膨脹及鑄型形成；與I/R組相比，I/R+agomir組腎小球壞死和肥大顯著減輕，小管膨脹及鑄型形成明顯減少；見(jiàn)OSID碼圖1。各組血清BUN、Scr及腎組織損傷評(píng)分比較見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清BUN、Scr及腎組織損傷評(píng)分比較（±s）

表1 各組大鼠血清BUN、Scr及腎組織損傷評(píng)分比較（±s）

注：與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組、I/R+agomir+LY組比較，#P<0.05。

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2.3 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白表達(dá)比較與Sham組比較，I/R+agomir組、I/R組、I/R+agomir+LY組腎組織細(xì)胞凋亡率均升高，且I/R組、I/R+agomir+LY組升高更明顯（P均<0.05）；各組腎組織細(xì)胞凋亡情況見(jiàn)OSID碼圖2。與Sham組、I/R+agomir組比較，I/R組、I/R+agomir+LY組腎組織促凋亡蛋白Bax表達(dá)均升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)均降低（P均<0.05）；見(jiàn)表2和OSID碼圖3。

表2 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05；與I/R+agomir+LY組比較，△P<0.05。

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2.4 各組大鼠腎組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較與Sham組、I/R+agomir組比較，I/R組、I/R+agomir+LY組大鼠腎組織LC3B熒光表達(dá)強(qiáng)度、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)均升高，Atg5蛋白表達(dá)均降低（P均<0.05）；見(jiàn)表3和OSID碼圖4、5。

表3 各組大鼠腎組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠腎組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05；與I/R+agomir+LY組比較，△P<0.05。

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2.5 各組大鼠腎組織AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白達(dá)水平比較與Sham組、I/R+agomir組比較，I/R組、I/R+agomir+LY組大鼠腎組織p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR均降低（P均<0.05）；見(jiàn)表4和OSID碼圖6。

表4 各組大鼠腎組織AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠腎組織AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05；與I/R+agomir+LY組比較，△P<0.05。

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3 討論

AKI主要由腎I/R損傷、膿毒癥和腎毒性藥物（如順鉑、環(huán)孢素、馬兜鈴酸）引起，主要特點(diǎn)是通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)率檢測(cè)到腎功能迅速下降。越來(lái)越多的研究證實(shí)，自噬參與了腎I/R損傷誘導(dǎo)的AKI［7］。此外，自噬在腎I/R損傷中也起雙向調(diào)節(jié)作用，在腎I/R早期，適當(dāng)?shù)淖允杉せ钣斜Ｗo(hù)作用。KANG等［8］研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸戊乙奎醚可通過(guò)誘導(dǎo)自噬促進(jìn)腎細(xì)胞增殖，并抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制腎I/R損傷的發(fā)生發(fā)展。XIE等［9］研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理可通過(guò)上調(diào)自噬流促進(jìn)自噬，以減輕腎I/R損傷。BIAN等［10］研究發(fā)現(xiàn)，自噬缺陷會(huì)加重腎損傷，并與C反應(yīng)蛋白高表達(dá)相關(guān)。而在腎I/R損傷晚期過(guò)度激活自噬反而會(huì)加重腎臟損傷，一些抑制過(guò)度自噬的制劑被證明對(duì)腎I/R損傷具有腎保護(hù)作用。TAN等［11］證明，纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子10可以通過(guò)mTOR途徑抑制過(guò)度自噬，從而保護(hù)腎I/R損傷大鼠的腎功能、減少其腎損傷評(píng)分。FANG等［12］研究發(fā)現(xiàn)，miR?30a?5p可通過(guò)調(diào)節(jié)Beclin?1/ATG16通路而減輕自噬，從而緩解腎I/R損傷。NAKAGAWA等［13］證明，使用mTOR抑制劑依維莫司誘導(dǎo)自噬反應(yīng)，加重了AKI患者的腎小管功能障礙。因此，在不同的腎I/R損傷進(jìn)程中，自噬對(duì)細(xì)胞存活和死亡有不同的調(diào)節(jié)功能。腎I/R損傷早期階段自噬提供了保護(hù)作用，但晚期或過(guò)度自噬可促進(jìn)細(xì)胞凋亡和后期細(xì)胞死亡，導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞損傷。通過(guò)對(duì)腎I/R損傷不同階段自噬進(jìn)行靶向調(diào)節(jié)，可以起到緩解腎I/R損傷誘發(fā)AKI的作用，從而為預(yù)防和治療腎I/R損傷提供新的治療方法。本研究結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率、LC3B熒光強(qiáng)度、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及促凋亡蛋白Bax、Beclin1蛋白表達(dá)明顯升高，抗凋亡蛋白Bcl-2及Atg5蛋白表達(dá)明顯下降；這表明在腎I/R損傷大鼠晚期的自噬水平明顯上調(diào)，通過(guò)抑制晚期過(guò)度自噬繼而減少細(xì)胞凋亡可能成為預(yù)防和治療腎I/R損傷的新策略。

多個(gè)在體和離體實(shí)驗(yàn)已表明，miR-145-5p對(duì)多種腎臟疾病的診斷和治療具有指導(dǎo)意義［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-145-5p在心肌和腦組織I/R損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［4-5］。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-145-5p參與到了細(xì)胞自噬的調(diào)控過(guò)程中［15］。然而，miR-145-5p能否通過(guò)調(diào)節(jié)晚期自噬發(fā)揮減輕腎I/R損傷的作用仍待進(jìn)一步明確。本研究結(jié)果顯示，與I/R組 相 比，I/R+agomir組 大 鼠 給 予agomir上 調(diào)miR-145-5p表達(dá)后，可以顯著降低大鼠血清BUN、Scr水平及腎組織損傷評(píng)分，減少腎組織細(xì)胞凋亡率、LC3B熒光強(qiáng)度、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及促凋亡蛋白Bax、Beclin1蛋白表達(dá)，并升高抗凋亡蛋白Bcl-2及Atg5蛋白表達(dá)；這表明過(guò)表達(dá)miR-145-5p對(duì)腎I/R損傷大鼠的晚期自噬具有明顯抑制作用，進(jìn)而減輕了腎臟損傷。

自噬激活過(guò)程需要通過(guò)不同的信號(hào)通路介導(dǎo)，AKT/mTOR信號(hào)通路是其中重要的一條［16］。AKT又稱蛋白激酶B（PKB），是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，正常情況下調(diào)節(jié)下游多種靶蛋白表達(dá)。mTOR是自噬調(diào)節(jié)中研究最多的靶蛋白之一，細(xì)胞中的mTOR以兩種復(fù)合物的形式存在，即mTOR1和mTOR2，調(diào)節(jié)自噬的主要為mTOR1［17］。在生長(zhǎng)條件下，Ⅰ類(lèi)PI3K激活絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT，之后通過(guò)一系列的調(diào)控使mTOR磷酸化，從而抑制自噬。而在營(yíng)養(yǎng)饑餓、缺氧等應(yīng)激下，mTOR信號(hào)通路被抑制，從而使自噬順利被誘導(dǎo)［18］。通過(guò)AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)，對(duì)于自噬介導(dǎo)相關(guān)疾病的干預(yù)有重要意義。此外，miR-145-5p與AKT/mTOR通路間也存在某種聯(lián)系。GAO等［19］研究顯示，通過(guò)海綿化miR-145-5p激活PRKCI/AKT/mTOR通路是circPARD3抑制自噬、促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展和化療耐藥的主要機(jī)制。因而，我們進(jìn)一步猜想miR?145?5p可能是通過(guò)激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路而抑制了晚期腎I/R損傷后自噬的過(guò)度激活，進(jìn)而減輕腎I/R損傷。本研究結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組大鼠腎組織p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR均下降；與I/R組比較，I/R+agomir組大鼠腎組織中p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR均升高，表明miR?145?5p與AKT/mTOR信號(hào)通路間存在上下游調(diào)控關(guān)系；而腹腔注射AKT信號(hào)特異性抑制劑LY294002后的I/R+agomir+LY組較I/R+agomir組腎組織p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR均降低，提示LY294002阻斷AKT/mTOR信號(hào)通路的同時(shí)，也阻斷了miR?145?5p對(duì)腎I/R損傷大鼠晚期自噬的抑制作用，并且逆轉(zhuǎn)了miR?145?5p對(duì)腎I/R損傷大鼠的腎臟保護(hù)作用。

綜上所述，miR?145?5p可以通過(guò)激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路來(lái)抑制晚期自噬的過(guò)度激活，從而減輕了腎I/R后大鼠的腎損傷，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。本研究闡明了miR?145?5p在腎I/R損傷中的保護(hù)機(jī)制，同時(shí)也為臨床應(yīng)用miR?145?5p作為靶點(diǎn)治療腎I/R損傷提供了更詳實(shí)的理論基礎(chǔ)。