HVEM基因干擾后非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力變化及其機(jī)制

陳祥，鄭江南，包蕾，劉玉鳳

蘇州市第九人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇蘇州 215000

肺癌的發(fā)病率及病死率均位于全球首位，80%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），嚴(yán)重威脅人類健康［1-3］。皰疹病毒侵入介體（HVEM）屬于腫瘤壞死因子受體超家族，主要表達(dá)于免疫細(xì)胞，對(duì)T淋巴細(xì)胞活化和增殖具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用［4］。研究表明，HVEM在肺癌、腎透明細(xì)胞癌和黑色素瘤等多種腫瘤中表達(dá)異常升高，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［5-7］。目前，關(guān)于HVEM影響NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制報(bào)道較少。2021年6月—2022年6月，本研究觀察了HVEM基因干擾對(duì)NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲的影響，并探討其可能的機(jī)制，為肺癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料細(xì)胞：人NSCLC細(xì)胞系SK-MES-1、H1299、H460、H226、H520和正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B均購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，復(fù)蘇后置于含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青—鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，青—鏈霉素購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司，Lipo?fectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，siRNA購(gòu)自上海金唯智生物科技有限公司，Tran?swell小室、Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Corning公司，鼠抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimen?tin）、HVEM、β-actin單抗以及兔抗人N-鈣黏蛋白（Ncadherin）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）單抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司。主要儀器：電泳儀、PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 高表達(dá)HVEM的NSCLC細(xì)胞篩選采用Western blotting法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NSCLC細(xì)胞系SK-MES-1、H1299、H460、H226、H520和正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B，加入500 μL RIPA裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min離心30 min。取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，調(diào)整蛋白至相同的濃度。100℃水浴7 min使蛋白變性，按每孔50 μg蛋白樣品加樣，10% SDS-PAGE垂直電泳分離目的蛋白。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入HVEM及內(nèi)參β-actin一抗，4℃孵育過(guò)夜；加入二抗，室溫孵育2 h。ECL顯影檢測(cè)蛋白表達(dá)，暗室曝光拍照。采用Image J圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算HVEM蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，NSCLC細(xì)胞系SK-MES-1、H1299、H460、H226、H520和正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B的HVEM蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.37±0.05、0.91±0.04、0.56 ±0.04、0.26±0.06、0.68±0.05、0.35±0.04；與BEAS-2B細(xì)胞比較，NSCLC細(xì)胞H1299、H460、H520的HVEM蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，且H1299細(xì)胞升高最明顯（P均<0.05）。選擇H1299細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染處理取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1299細(xì)胞，以4×105/孔接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合至80%，PBS洗滌2次；更換無(wú)FBS和抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。將H1299細(xì)胞分為si-NC組、si-HVEM-1組和si-HVEM-2組，分別采用Lipofectamine 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染si-NC、si-HVEM-1和si-HVEM-2干擾序列，轉(zhuǎn)染48 h。si-NC轉(zhuǎn)染序列：5′-CCCAGUAAUAGGACACCAATT-3′，si-HVEM-1轉(zhuǎn)染序列：5′-ACACGAUAACCUGGACUGCTT-3′，si-HVEM-2轉(zhuǎn) 染 序 列：5′-AUUAGGCCAACUGUG?GAGCTT-3′。

1.4 細(xì)胞侵襲能力觀察采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。將Matrigel基質(zhì)膠放入4℃冰箱緩慢融化，用不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基按1∶6的比例對(duì)Matrigel基質(zhì)膠進(jìn)行稀釋，取40 μL稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠鋪在Transwell小室上室，37℃培養(yǎng)箱靜置3～4 h。待Matrigel基質(zhì)膠干成膠狀后，用胰酶消化轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，向經(jīng)基質(zhì)膠包被的小室上室加入150 μL細(xì)胞懸液，下室加入800 μL完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，取出小室并洗滌，甲醇固定后用結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞遷移能力觀察采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。取各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，向Transwell小室上室加入150 μL細(xì)胞懸液，下室加入800 μL完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，取出小室并洗滌，甲醇固定后用結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 細(xì)胞HVEM、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-catenin mRNA檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。收集各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，酶標(biāo)儀測(cè)定RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL、10 μmol/L正反向引物各1 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 5.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃變性15 s，28℃退火45 s，72℃延伸60 s，共38個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.7 細(xì)胞HVEM、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-catenin蛋白檢測(cè)收集各組轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，以β-actin為內(nèi)參，參照1.2采用Western blotting法檢測(cè)HVEM、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和βcatenin蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用S-W正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較si-NC組、si-HVEM-1和si-HVEM-2組遷移細(xì)胞數(shù)分別為（243±23）、（116±9）、（69±15）個(gè)，侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（285±18）、（154±24）、（46±8）個(gè)；與si-NC組比較，si-HVEM-1組和si-HVEM-2組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均減少，且si-HVEM-2組減少更明顯（P均<0.05）。見(jiàn)OSID碼圖1。

2.2 各組細(xì)胞HVEM mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較si-NC組、si-HVEM-1組和si-HVEM-2組HVEM mRNA相 對(duì) 表 達(dá) 量 分 別 為0.19±0.02、0.12±0.01、0.09±0.01，HVEM蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.91±0.02、0.67±0.06、0.37±0.03；與si-NC組比較，si-HVEM-1組和si-HVEM-2組HVEM mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，且si-HVEM-2組降低更明顯（P均<0.05）。見(jiàn)OSID碼圖2。

2.3 各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、βcatenin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1 各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與si-NC組比較，*P<0.05；與si-HVEM-1組比較，#P<0.05。

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2.4 各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β- catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表2、OSID碼圖3。

表2 各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表2 各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與si-NC組比較，*P<0.05；與si-HVEM-1組比較，#P<0.05。

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3 討論

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中80%以上為NSCLC。NSCLC的早期診斷困難，確診時(shí)大多數(shù)已處于晚期且伴隨轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后不佳，5年生存率不 足5%［8-10］。HVEM在 淋 巴 細(xì) 胞 上 高 表 達(dá)，當(dāng)HVEM與腫瘤壞死因子超家族成員14（TNFSF14）或B、T淋巴細(xì)胞衰減因子（BTLA）結(jié)合時(shí)，可傳遞共刺激或共抑制信號(hào)，調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)［11-12］。

HVEM屬于腫瘤壞死因子受體超家族，其在T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞上表達(dá)。HVEM作為配體與LIGHT相結(jié)合，可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并通過(guò)活化NF-κB/p50信號(hào)通路促進(jìn)NK細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素（IFN-γ）［13］。HVEM也可與BTLA結(jié)合，抑制腫瘤特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)功能，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸［11，14］。HVEM在多種腫瘤如肺癌、腎透明細(xì)胞癌和黑色素瘤中也異常高表達(dá)［5-7］。臨床研究表明，腫瘤中HVEM高表達(dá)與低水平的腫瘤浸潤(rùn)性T淋 巴 細(xì) 胞 相 關(guān)，提 示 患 者 預(yù) 后 較 差［6，15-16］。HVEM不僅能調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，還可通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。研究報(bào)道，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中干擾HVEM表達(dá)可以抑制食管癌和腎透明細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖［7，17］。在缺氧環(huán)境下，HVEM可以通過(guò)上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖［18］。本研究結(jié)果顯示，干擾HVEM表達(dá)后H1299細(xì)胞遷移和侵襲能力降低，提示表達(dá)下調(diào)可抑制肺癌細(xì)胞H1299的遷移和侵襲。

上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是細(xì)胞由上皮細(xì)胞表型向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一種現(xiàn)象。在EMT過(guò)程中，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)以及間質(zhì)標(biāo)志物Ncadherin、Vimentin表達(dá)上調(diào)，同時(shí)細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞基質(zhì)的黏附減少，從而使細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，干擾HVEM表達(dá)后H1299細(xì)胞E-cadherin表達(dá)上調(diào)，而N-cadherin、Vimentin表達(dá)下調(diào)，表明HVEM表達(dá)下調(diào)可抑制肺癌細(xì)胞EMT。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在EMT過(guò)程中發(fā)揮重要作用［19］。Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化后，βcatenin在細(xì)胞質(zhì)中大量累積并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，入核的β-catenin與T淋巴細(xì)胞因子/淋巴樣增強(qiáng)因子結(jié)合并形成復(fù)合物，激活Wnt下游的靶基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生［20］。本研究結(jié)果顯示，干擾HVEM表達(dá)后H1299細(xì)胞β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)均降低，提示HVEM表達(dá)下調(diào)抑制肺癌細(xì)胞EMT的機(jī)制可能與阻斷細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，HVEM在NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)，干擾HVEM基因會(huì)降低NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化而抑制EMT的發(fā)生有關(guān)。本研究為臨床治療肺癌提供了新的靶點(diǎn)及理論依據(jù)，但未能闡明HVEM對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的具體調(diào)控機(jī)制，尚需進(jìn)一步深入研究。