BTG2、ARL2在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達及與其臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性

杜偉鵬 徐 曼 汪海霞 包 孟

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因之一，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的80%以上[1-2]。盡管近年來在NSCLC的早期診斷和治療方面取得了一些進展，但NSCLC患者的預(yù)后仍然很差[3]。當(dāng)前的研究方向是確定新的治療靶點和策略，并將它們納入現(xiàn)有的治療方案，以提高治療效果。ADP的核糖基化樣因子2(ARL2)是ADP核糖基化因子(ARF)家族的成員，是位于11號染色體(11q13)上的高度保守基因。ARF亞家族在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)中起重要作用[4]。ARL2的過度表達能夠?qū)⒔Y(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移、增殖和致瘤性進行抑制[5]。在宮頸癌中，ARL2表達較其癌旁組織更高，且與患者不良預(yù)后相關(guān)[6]。BTG2(B細(xì)胞異位基因2)基因是BTG/TOB家族的重要成員。已知該家族基因的過度表達在體外抑制細(xì)胞增殖，BTG蛋白可能在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)或細(xì)胞凋亡中起作用[7]。BTG2 mRNA在胸腺癌組織中表達丟失，而在小鼠胸腺中高表達，這表明BTG2在胸腺癌變過程中具有潛在作用[8]。此外，與非致瘤性乳腺上皮細(xì)胞相比，BTG2在人乳腺癌細(xì)胞系中的表達明顯降低[9]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，ARL2、BTG2均是急性髓系白血病的促凋亡基因，二者與急性髓系白血病的化療耐藥有關(guān)[10]。但是目前尚無關(guān)于ARL2、BTG2表達與NSCLC關(guān)系的研究報道，因此本研究擬探討ARL2、BTG2蛋白在NSCLC患者癌組織中表達水平及臨床預(yù)后意義，以期為NSCLC的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年10月至2016年9月間本院收治的非小細(xì)胞肺患者126例為研究對象，收集相應(yīng)的原發(fā)NSCLC組織及相應(yīng)的癌旁正常組織。標(biāo)本用10%福爾馬林固定并包埋在石蠟中進行病理檢測及免疫組化檢測。該研究獲得本院研究倫理委員會的批準(zhǔn)。在手術(shù)前獲得患者的知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷確認(rèn)為非小細(xì)胞肺癌；②患者術(shù)前未接受化療或放療；③NSCLC疾病組織學(xué)根據(jù)世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)確定；④根據(jù)當(dāng)前國際抗癌聯(lián)盟腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分類進行病理分期。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡、性別、病史和腫瘤信息不完整；②術(shù)后隨訪失敗或死亡原因不明；③存在其他惡性腫瘤或惡性腫瘤因其他突發(fā)疾病(包括心腦血管疾病)死亡；④懷孕或哺乳的患者。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組化法測定ARL2、BTG2表達及判定標(biāo)準(zhǔn) 對所有126個組織標(biāo)本進行免疫組織化學(xué)分析。切片在二甲苯中脫蠟，并使用分級酒精系列脫水，然后用甲醇中的0.5% H2O2封閉內(nèi)源性的過氧化物酶活性10 min。在室溫條件將切片和10%正常山羊血清于磷酸鹽的緩沖鹽水 (PBS) 內(nèi)孵育1 h把非特異性抗原阻斷。在不洗滌的情況下，將切片與抗ARL2、BTG2(1∶1000，1∶2000；中國碧云天生物科技)在PBS中于4 ℃下孵育過夜。生物素化山羊抗兔免疫球蛋白 G(1∶400；Sigma，St Louis MO，USA)與切片在室溫下孵育1 h，并用鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物檢測。通過將切片與0.1% 3,3-二氨基聯(lián)苯胺(Sigma)在含有0.05% H2O2的PBS中室溫孵育5 min。組織標(biāo)本由兩名病理學(xué)家在雙盲條件下分別查看，其事先不了解標(biāo)本的臨床病理狀態(tài)。ARL2、BTG2在NSCLC標(biāo)本中的表達通過在低倍(×40)下掃描整個組織標(biāo)本進行評估，然后在高倍(×200和×400)下進行確認(rèn)。陽性細(xì)胞的百分比被記為“0”(<5%，陰性)、“1”(5%～25%，弱陽性)、“2”(25%～50%，中陽性)和“3”(>50%，強陽性)，分別染色強度分別記為“0”(無染色)、“1”(弱染色)、“2”(中等染色)和“3”(強染色)。陽性細(xì)胞百分比和細(xì)胞染色強度均以雙盲方式確定。最終ARL2、BTG2免疫染色分?jǐn)?shù)是使用陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)的百分比乘以染色強度分?jǐn)?shù)計算的，范圍為0～9。

1.2.2 隨訪 術(shù)后的每3個月利用電話及問卷調(diào)查方式將全部的合格患者的信息進行更新。從最開始的手術(shù)日期直至死亡時間點計算總生存期。通過家庭報告確定參與者的死亡，并通過查閱公共記錄進行核實。所有患者出院后均電話隨訪5年，隨訪率為100%。

1.3 統(tǒng)計分析

應(yīng)用統(tǒng)計軟件包SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗分析ARL2、BTG2表達與臨床病理特征的關(guān)系，使用log-rank檢驗分析生存率差異，多因素Cox比例風(fēng)險模型探討預(yù)后相關(guān)因素，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 ARL2、BTG2在癌旁組織、非小細(xì)胞肺癌組織中表達比較

由表1可見，非小細(xì)胞肺癌組中ARL2蛋白陽性率高于癌旁組(66.7% vs 25.4%)，BTG2蛋白陽性率低于癌旁組(20.6% vs 71.4%)(P<0.05)。

表1 ARL2、BTG2在癌旁組、非小細(xì)胞肺癌組中表達比較(例，%)

2.2 ARL2、BTG2蛋白表達與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

由表2可見，ARL2、BTG2蛋白表達與患者年齡、性別無關(guān)(P>0.05)；與腫瘤最大直徑、浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級、復(fù)發(fā)相關(guān)，且腫瘤最大直徑至少5 cm、浸潤深度越深、TNM分期越高、病理級別越高、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)非小細(xì)胞肺癌患者ARL2陽性表達率更高，BTG2陽性表達率更低(P<0.05)。

2.3 非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后生存情況

126例非小細(xì)胞肺癌患者中，自出院后至隨訪結(jié)束存活4～60個月，5年生存率為47.6%(60/126)；其中ARL2陽性和陰性5年總生存率分別為26/84(31.0%)和34/42(81.0%)，而BTG2陽性和陰性5年總生存率分別為25/26(96.1%)和35/100(35.0%)；ARL2陰性、BTG2陽性非小細(xì)胞肺癌患者5年生存率均顯著增高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=21.254、18.205，P<0.001)。

表2 ARL2、BTG2蛋白表達與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

2.4 影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的單因素分析

單因素分析得出：腫瘤最大直徑至少3 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、浸潤深度至少為1 cm、出現(xiàn)了淋巴血管浸潤、有復(fù)發(fā)、高病理級別、ARL2陽性、BTG2陰性的非小細(xì)胞肺癌患者5年內(nèi)生存率下降明顯(P<0.05)，見表 3。

表3 影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的單因素分析(例，%)

2.5 非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后影響因素多因素Cox回歸分析

Cox回歸分析顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、病理級別高、ARL2陽性、BTG2陰性是影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

3 討論

NSCLC是最常見的肺癌類型，其5年總生存率僅為39%[11]。最近，腫瘤的分子靶向治療已被引入臨床治療，靶向癌癥治療的出現(xiàn)顯著增加了患者生存期，同時最大限度地減少治療毒性。然而，內(nèi)在或獲得性耐藥機制限制了它們的臨床療效。因此，更好地了解NSCLC的分子機制有助于確定新的治療靶點或開發(fā)新的NSCLC治療方式。

ARL2是一種核和細(xì)胞外蛋白，參與多種生理和病理狀況，包括免疫反應(yīng)、炎癥和癌癥。比較源自卵巢癌的高侵襲性和低侵襲性亞克隆的基因表達譜的cDNA微陣列分析表明，高ARL2表達與較差的臨床病理特征相關(guān)[12]。根據(jù)細(xì)胞定位，ARL2表達于癌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞外間隙，與食管鱗狀細(xì)胞癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。ARL2過表達與腫瘤分級、分期、較短的無病生存期和顯著相關(guān)。從功能上講，ARL2是成年生物體中自噬、線粒體質(zhì)量控制、基因表達調(diào)節(jié)和器官功能所必需的[13]。敲除ARL2通過VEGF-C和NF-KB通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而ARL2的異位表達通過抑制BTB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞遷移來促進前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲；此外ARL2通過信號素3A的表觀遺傳沉默，降低Bax和p53表達，并通過激活FAK/PI3K/mTOR通路增強Bcl-xL、Bcl-2、CyclinD1和NFKB的表達進而促進癌細(xì)胞增殖[14]。此外，細(xì)胞外ARL2增強了對P-gp相關(guān)藥物(阿霉素和長春新堿)的抗性，而敲除ARL2可恢復(fù)化學(xué)敏感性[15]。在本研究中，我們通過免疫組化法測定出ARL2表達在NSCLC組織中顯著高于相鄰非腫瘤組織中的表達。這些觀察結(jié)果支持ARL2可能作為NSCLC中的致癌基因的假設(shè)，也表明ARL2可能在NSCLC的腫瘤發(fā)生中起重要作用。此外，為了研究ARL2表達是否與NSCLC的進展有關(guān)，通過免疫組織化學(xué)比較了126例NSCLC患者的ARL2表達水平和臨床病理特征。我們發(fā)現(xiàn)ARL2高表達與腫瘤分級、腫瘤大小、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示ARL2高表達與NSCLC患者的總生存率呈負(fù)相關(guān)。更重要的是，使用Cox回歸模型的進一步分析證實，ARL2表達是預(yù)測NSCLC患者總生存時間的獨立因素。這些發(fā)現(xiàn)提供了證據(jù)表明ARL2可被視為預(yù)測NSCLC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

BTG2是早期生長反應(yīng)基因，在多種器官和組織中高度表達，包括肺、腸、胰腺和前列腺。BTG2的過表達可抑制某些腫瘤(包括腎癌細(xì)胞)的細(xì)胞增殖和侵襲，并與PRMT1協(xié)同發(fā)揮抗增殖基因的作用[16]；BTG2參與癌細(xì)胞的發(fā)育和分化，可以促進視黃酸誘導(dǎo)的造血細(xì)胞分化；BTG2能夠促進或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞侵襲；BTG2是p53靶基因之一，參與DNA損傷修復(fù)過程。它通過依賴于p53的Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起作用，并在DNA受損時顯著增加表達，BTG2在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[17-18]。近期研究發(fā)現(xiàn)，BTG2是p53依賴性Ras途徑中的主要下游抗活性效應(yīng)物，與人類腫瘤發(fā)生中的p53途徑相關(guān)。BTG2通過抑制PI3K/AKT通路來抑制癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[19]。此外，BTG2過表達通過下調(diào)STAT3通路抑制白細(xì)胞介素6(IL-6)表達，并抑制JAK2-STAT3信號通路中活性氧(ROS)的產(chǎn)生，對癌細(xì)胞的生長有負(fù)面影響。BTG2表達也被氧化應(yīng)激通過ROS蛋白激酶C-ΝFκΒ途徑上調(diào)，該途徑與p53狀態(tài)無關(guān)。因此，BTG2參與了一些對癌癥發(fā)展和進展至關(guān)重要的途徑。本研究中非小細(xì)胞肺癌組BTG2蛋白表達陽性率低于癌旁組；BTG2蛋白表達與腫瘤最大徑、TNM分期、浸潤深度、病理級別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)性明顯，且腫瘤最大腫瘤直徑至少3 cm、TNM的分期為Ⅲ～Ⅳ期、浸潤深度至少為1 cm、出現(xiàn)了淋巴血管的浸潤、有復(fù)發(fā)、高病理級別、ARL2陽性、BTG2陰性的非小細(xì)胞肺癌患者5年內(nèi)的生存率縮短明顯(P<0.05)。TNM的分期為Ⅲ～Ⅳ期、高病理級別、ARL2陽性、BTG2陰性是影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)。這提示，BTG2蛋白在非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中低表達，BTG2低表達是非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨立危險因素。

表4 非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后影響因素多因素Cox回歸分析

綜上所述，非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中ARL2表達升高，BTG2蛋白表達降低；ARL2高表達、BTG2低表達是影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨立危險因素。