CD133及PANTR1在乳腺癌中的表達(dá)特征及其與細(xì)胞體外增殖和侵襲能力的關(guān)系

左永剛 溫玉清 王 璇 馬明德

乳腺癌為女性常見(jiàn)惡性腫瘤，臨床患病率較高，且近年隨著人們生活方式變化及生活壓力的增加，臨床發(fā)病率呈明顯升高趨勢(shì)，且逐漸趨于年輕化，嚴(yán)重威脅女性群體身心健康及生命安全[1-2]。臨床針對(duì)乳腺癌的診治措施已獲得明顯進(jìn)步，而復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移仍是該病患者總生存率未得到明顯提高的關(guān)鍵所在[3-4]。CD133為腫瘤干細(xì)胞的特征性表面標(biāo)志物之一，但在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制尚未明晰[5]。PANTR1被發(fā)現(xiàn)參與胃癌、結(jié)直腸癌等腫瘤細(xì)胞的惡性表型的調(diào)節(jié)[6]。因此，明確CD133與PANTR1在乳腺癌組織內(nèi)的表達(dá)特征與其同細(xì)胞體外增殖和侵襲能力之間的關(guān)系，對(duì)于臨床及時(shí)了解乳腺癌病情嚴(yán)重程度、制定科學(xué)規(guī)范化治療措施、提高患者生存率具有重要意義。基于此，本研究以380例乳腺癌患者為研究對(duì)象，探究CD133與PANTR1在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義。報(bào)告示下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年10月至2020年10月本院診治的380例女性乳腺癌患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均經(jīng)病理檢查證實(shí)為乳腺癌；患者病歷有關(guān)資料齊全；患者納入遵照自愿原則，依從性較高，且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在神經(jīng)疾患者；合并免疫系統(tǒng)病癥者；合并血液系統(tǒng)疾病者；存有精神疾患、視聽(tīng)障礙或難以進(jìn)行正常交流者；存在全身性感染者；存有嚴(yán)重的腦器質(zhì)性疾病者；合并嚴(yán)重的腦器質(zhì)性疾病者。所有患者年齡31～57歲，平均年齡(40.67±4.35)歲；體重指數(shù)18.6～27.1 kg/m2，平均體重指數(shù)(23.89±0.64)kg/m2。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與檢測(cè) 于術(shù)中取所有患者的癌組織(癌組織組)與癌旁正常組織(癌旁正常組織組)，以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PT-PCR)法檢測(cè)2組的CD133與PANTR1表達(dá)，即取乳腺癌組織與各組細(xì)胞總RNA，取RNA 1 μg施以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，設(shè)定3個(gè)重復(fù)樣本，以GAPDH為內(nèi)參，之后以2-ΔΔCt法計(jì)算CD133與PANTR1 RNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 細(xì)胞體外增殖能力 取相對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)密度接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并劃分成對(duì)照組、CD133過(guò)表達(dá)組、PANTR1過(guò)表達(dá)組、CD133抑制組以及PANTR1抑制組，對(duì)照組予以Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染，CD133過(guò)表達(dá)組予以Lipofectamine 2000以及CD133序列，PANTR1過(guò)表達(dá)組給予Lipofectamine 2000以及PANTR1序列，CD133抑制組予以Lipofectamine 2000以及si-CD133序列，PANTR1抑制組給予Lipofectamine 2000以及si-PANTR1序列；之后以1%FBS培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為每孔3×104個(gè)，設(shè)置0、24、48、72、96 h時(shí)間點(diǎn)，各組設(shè)定5個(gè)重復(fù)樣本，加入1/10體積CCK-8試劑，測(cè)定450 nm處的光密度值，以0 h為基值計(jì)算96 h細(xì)胞增殖倍數(shù)，以此為細(xì)胞相對(duì)增殖能力。

1.2.3 細(xì)胞侵襲能力 以1%FBS培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔3×104個(gè)，接種至存有Matri-gel基質(zhì)膠的Transwell小室中，下室置入10%FBS培養(yǎng)基，24 h后固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，400×光鏡拍照并計(jì)數(shù)，各組選5個(gè)隨機(jī)視野并予以細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)癌組織及癌旁組織中CD133與PANTR1表達(dá)情況。(2)對(duì)照組與CD133過(guò)表達(dá)組、PANTR1過(guò)表達(dá)組、CD133抑制組以及PANTR1抑制組CD133與PANTR1表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 2組CD133與PANTR1表達(dá)對(duì)比

癌組織組的CD133與PANTR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于癌旁正常組織組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組CD133與PANTR1表達(dá)對(duì)比

2.2 對(duì)照組與CD133過(guò)表達(dá)組、PANTR1過(guò)表達(dá)組MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)情況對(duì)比

CD133、PANTR1過(guò)表達(dá)組MCF-7細(xì)胞增殖倍數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 對(duì)照組與CD133抑制組以及PANTR1抑制組MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)情況對(duì)比

CD133、PANTR1抑制組的MCF-7細(xì)胞增殖倍數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 對(duì)照組與CD133過(guò)表達(dá)組、PANTR1過(guò)表達(dá)組MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)情況對(duì)比

表3 對(duì)照組與CD133抑制組以及PANTR1抑制組MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)情況對(duì)比

3 討論

乳腺癌為嚴(yán)重危害女性生命健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死風(fēng)險(xiǎn)均較高[7]。盡管乳腺癌的診斷與治療取得長(zhǎng)足進(jìn)展，然而乳腺癌細(xì)胞易于脫落，其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及死亡率未有明顯的改善。相關(guān)研究表明，乳腺癌內(nèi)存有具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，此類細(xì)胞可能是乳腺癌進(jìn)展、復(fù)發(fā)的根本所在，臨床應(yīng)加以重視[8-9]。

腫瘤是由存在不同增殖潛能的異質(zhì)細(xì)胞組合而成，此類細(xì)胞雖數(shù)目較少，但可通過(guò)移植進(jìn)而產(chǎn)生腫瘤，故被稱作腫瘤干細(xì)胞[10-11]。CD133作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志之一，屬于Prominin家族成員，含有5次跨膜結(jié)構(gòu)，分子量為120 kb，其首次發(fā)現(xiàn)于白血病患者中[12-13]。但臨床關(guān)于CD133在乳腺癌組織內(nèi)的表達(dá)尚未明晰。本研究結(jié)果顯示，癌組織組的CD133[(0.023±0.002)]高于癌旁正常組織組[(0.006±0.001)]，提示在乳腺癌患者癌灶組織內(nèi)CD133表達(dá)水平明顯升高。CCK-8與Transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力與侵襲能力研究結(jié)果顯示，CD133過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖倍數(shù)[(10.54±1.45)]與侵襲細(xì)胞數(shù)[(43.88±3.69)個(gè)]均高于對(duì)照組[(6.84±0.69)]，而CD133抑制組的細(xì)胞增殖倍數(shù)[(5.23±0.25)]與侵襲細(xì)胞數(shù)[(18.35±1.64)個(gè)]均低于對(duì)照組[(6.84±0.69)、(23.25±2.15)個(gè)]，可見(jiàn)CD133參與乳腺癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，其過(guò)高表達(dá)對(duì)于乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力具有增強(qiáng)作用。而PANTR1基因?yàn)樘幵谌巳旧w2q12上的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)，在胃癌等不同種類的腫瘤組織內(nèi)均高度表達(dá)，在多種惡性腫瘤內(nèi)發(fā)揮促癌作用[14-15]。本研究結(jié)果顯示，癌組織組的PANTR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量[(0.018±0.002)]高于癌旁正常組織組[(0.005±0.001)]，表明PANTR1在乳腺癌組織內(nèi)呈高表達(dá)。CCK-8與Transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力與侵襲能力分析結(jié)果顯示，PANTR1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖倍數(shù)[(10.26±1.13)]與侵襲細(xì)胞數(shù)[(45.67±4.28)個(gè)]高于對(duì)照組[(6.84±0.69)、(23.25±2.15)個(gè)]，而PANTR1抑制組的細(xì)胞增殖倍數(shù)[(5.17±0.34)]與侵襲細(xì)胞數(shù)[(18.13±1.22)個(gè)]低于對(duì)照組[(6.84±0.69)、(23.25±2.15)個(gè)]，表明PANTR1與乳腺癌患者癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力密切相關(guān)。根據(jù)上述結(jié)果，可見(jiàn)CD133與PANTR1在乳腺癌組織內(nèi)呈異常表達(dá)狀態(tài)，其高表達(dá)會(huì)增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力，促使病情惡化，進(jìn)而危及患者生命安全。其原因?yàn)镃D133與PANTR1可通過(guò)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞Pum1/E2F3的表達(dá)，而E2F3可通過(guò)與miR-125b與miR-432-5p等多種蛋白與RNA相互作用，進(jìn)而增強(qiáng)癌細(xì)胞增殖與侵襲能力，影響乳腺癌的惡性行為。而Pum1則可當(dāng)成E2F3的上游基因，可促使E2F3的表達(dá)。但仍需注意的是，臨床現(xiàn)階段對(duì)于CD133、PANTR1與Pum1蛋白的相互作用尚未完全明晰，后續(xù)還需不斷完善試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)一步分析CD133、PANTR1與Pum1蛋白相互作用，為CD133、PANTR1作為乳腺癌診治的新靶點(diǎn)提供研究基礎(chǔ)。

綜上所述，CD133、PANTR1在乳腺癌組織內(nèi)呈異常表達(dá)，且與癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力密切相關(guān)。