五味子甲素對葡聚糖硫酸鈉誘導小鼠炎性腸病的保護作用

許 紅，李鑫磊，李若男，陳 喜，徐志立

(遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600)

炎性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一種主要累及消化系統的慢性炎癥性腸道疾病[1]。其病因和發病機制尚不清楚，通常認為是由機體內在原因(包括遺傳易感性、腸黏膜免疫異常和腸道微生態改變等)和外部因素(環境、飲食、生活方式變化等)共同作用所致[2]。IBD主要表現為腹痛、腹瀉、黏液膿血便，且反復發作，常給患者造成心理及生理上的巨大負擔。目前，IBD主要以水楊酸類、激素類、免疫抑制劑和生物制劑等藥物治療為主，但存在各種缺陷[3]。與西藥相比，傳統中藥價格低廉，副作用較小，為IBD的治療提供了新的治療思路。

五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.或華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果實。五味子甲素(Deoxyschizandrin)為五味子木脂素類的有效成分，有抑制腫瘤生長、抗炎、抗病毒的作用[4]。有研究表明，五味子甲素可通過調控炎性因子的水平，調節氧化應激反應以及抑制TNF-α/NF-κB等多種炎癥相關信號通路的激活，有效緩解模型動物的潰瘍性結腸炎[5-7]。本研究以3% DSS誘導小鼠IBD模型，探討預防性給藥條件下五味子甲素對于IBD小鼠的保護作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

五味子甲素(純度≥98%，批號：W-005-151221)購于南京道斯夫生物公司；柳氮磺吡啶腸溶片(SASP，批號：09200708)購于上海信誼天平公司；葡聚糖硫酸鈉(DSS，M/W50000)購于Sigma公司；RM2126石蠟切片機購于德國萊卡公司；顯微載玻片、組織包埋盒均購于江蘇世泰公司；TG16-WS臺式高速離心機購于湖南湘儀公司；DIV-86L386超低溫冰箱購于山東青島海爾公司；TP-114電子天平購于北京丹佛公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與模型制備 昆明種小鼠，雌雄各半，體質量26～33 g。隨機分為6組，每組10只。即正常組，模型組，五味子甲素高、中、低劑量組(80、40、20 mg/kg)，柳氮磺吡啶組。

1.2.2 給藥方法 除正常組飲用蒸餾水外，其余各組自由飲用3% DSS溶液連續16天，建立小鼠IBD模型。給藥組自造模起每日16∶00分別給予柳氮磺吡啶和不同濃度五味子甲素，給藥體積為0.2 mL/10 g。

1.2.3 檢測指標與方法 (1)小鼠一般生活習性及一般癥狀的觀察[8-10]。實驗第0、1、4、8、12、16天觀察記錄小鼠毛發與精神狀態、行動靈敏度、肛門便血情況及小鼠體質量。實驗第16天按隱血試劑盒說明書檢測小鼠隱血程度并進行隱血評分，計算小鼠疾病活動指數(DAI)。DAI=(體質量丟失率評分+糞便性狀評分+隱血程度評分)/3。體質量丟失率評分：體質量不變0分；體質量丟失1%～5%，1分；體質量丟失6%～10%，2分；體質量丟失11%～20%，3分；體質量丟失>20%，4分。糞便性狀評分：正常成型0分，松散樣糞便1分，半稀便樣糞便2分，稀便3分，水樣便4分。隱血程度評分：陰性0分，弱陽性1分，陽性2分，強陽性3分，肉眼可見便血(極強陽性)4分。

(2)小鼠結腸轉運時間、結腸質量及結腸指數的觀察。末次給藥2 h后，取直徑2 mm 的玻璃小球用靜脈輸液導管緩慢推入小鼠直腸3 cm處，將小鼠放回籠內，籠底墊白色A4紙，啟動計時器記錄小球排除時間。

取肛門至盲腸段小鼠結腸組織，稱重并計算結腸指數。結腸指數=結腸質量(g)/小鼠體質量(g)×100%。用預冷生理鹽水將腸腔沖洗干凈，置于4%多聚甲醛固定。

(3)HE染色法對小鼠結腸組織病理學的觀察。分離出的結腸組織使用4%多聚甲醛固定，流水沖洗后酒精梯度脫水，二甲苯透化。以二甲苯∶石蠟(1∶1)的混合液預處理后，將組織浸入石蠟包埋并切成4 μm的厚度，二甲苯脫蠟、梯度水化，蘇木素染色和伊紅染色，二度脫水加透化，中性樹膠封片，晾干后光學顯微鏡下觀察小鼠結腸組織形態和病理損傷情況。評分標準如下[11]：炎性細胞浸潤程度：無炎細胞浸潤，0分；固有層炎細胞數量增加，1分；炎細胞浸潤至黏膜下層，2分；透壁性炎細胞浸潤，3分；組織損傷程度：無黏膜損傷，0分；散在上皮損傷，1分；局灶性潰瘍形成，2分；廣泛性潰瘍形成延伸至腸壁，3分。

2 結果

2.1 五味子甲素對DSS誘導的IBD小鼠一般癥狀及體質量的影響

如圖1所示，造模期間，正常組小鼠精神狀況良好，活潑好動，毛皮柔順光澤，進食及飲水正常，肛門處未見出血異常；模型組小鼠精神萎靡，飲食攝入量明顯減少，長時間靜止不動，肛門處出現嚴重便血；給藥組小鼠，精神狀況一般良好，大便基本成型，肛門處紅腫有輕微便血出現。

注：A-F依次為正常組、模型組、五味子甲素高濃度組、五味子甲素中濃度組、五味子甲素低濃度組、柳氮磺吡啶組。

如圖2所示，禁食后實驗開始，第1天，各組小鼠體質量逐漸增加；實驗第8天除正常組體質量較快增長外，五味子甲素高濃度組和柳氮磺吡啶組增長速度變緩，五味子甲素中、低濃度組和模型組小鼠體質量有下降趨勢。實驗第16天，與正常組相比，模型組小鼠體質量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，五味子甲素高濃度組和柳氮吡啶組小鼠體質量顯著升高并接近正常水平(P<0.01)；五味子甲素中、低濃度組體質量略有降低，但跟模型組仍具有顯著性差異(P<0.01)。

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 五味子甲素對DSS誘導的IBD小鼠隱血程度及疾病活動指數的影響

如表1所示，與正常組相比，模型組小鼠隱血程度加重、DAI評分升高(P<0.01)。與模型組相比，給予40、80 mg/kg五味子甲素及柳氮磺吡啶后，小鼠隱血狀況緩解，DAI評分降低(P<0.05，P<0.01)。

表1 五味子甲素對DSS誘導的小鼠IBD模型結腸轉運時間和DAI的影響

2.3 五味子甲素對DSS誘導的IBD小鼠結腸質量、結腸轉運時間及結腸指數的影響

如表2所示，模型組小鼠結腸質量、結腸指數與正常組相比均顯著性增加，結腸轉運時間顯著性縮短(P<0.01)。與模型組相比，80 mg/kg五味子甲素及柳氮磺吡啶可以使IBD小鼠結腸質量減輕，結腸轉運時間延長，結腸指數降低并趨向正常(P<0.05，P<0.01)；40 mg/kg五味子甲素可降低IBD小鼠結腸指數(P<0.05)。

表2 五味子甲素對DSS誘導的小鼠IBD模型結腸質量的影響

2.4 五味子甲素對DSS誘導的IBD小鼠結腸組織病理損傷的影響

HE染色結果如圖3、圖4所示。正常組小鼠腸黏膜完整，各層無水腫及炎細胞浸潤。模型組小鼠結腸有大量炎性細胞浸潤，腸黏膜可見潰瘍灶，黏膜及黏膜下組織壞死，組織病理學評分顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，柳氮磺吡啶組80 mg/kg五味子甲素促使小鼠炎性細胞浸潤減少，潰瘍灶減少，黏膜水腫程度減輕，組織病理學評分降低(P<0.05，P<0.01)。

注：A-F依次為正常組、模型組、五味子甲素高濃度組、五味子甲素中濃度組、五味子甲素低濃度組、柳氮磺吡啶組。

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

目前，在炎性腸病臨床前研究中，多采用化學方法尤其是自由飲用DSS溶液誘導小鼠IBD模型[12]，其誘導小鼠結腸炎的機制可能與激活T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞，造成細胞因子表達改變，從而使腸上皮細胞黏膜屏障被破壞有關[13]。該方法操作方便，成功率高，且與人患IBD的機制更為接近，因此本研究亦應用3% DSS溶液誘導小鼠炎性腸病。

體質量和DAI是反映IBD小鼠造模成功與否最直觀的指標。IBD小鼠結腸黏膜屏障嚴重受損，體內炎癥因子水平升高，嚴重影響腸道對食物的消化與吸收。在造模16天里，正常組小鼠體質量逐漸升高；而模型組小鼠體質量逐漸下降，隱血程度和DAI評分增加，表明IBD小鼠造模成功。有文獻報道表明[14]，IBD小鼠結腸動力產生異常，結腸推進性收縮波增多，使推進速度加快。本研究發現，模型組小鼠結腸轉運時間顯著短于正常組，而給予柳氮磺吡啶、五味子甲素后，小鼠結腸轉運時間延長，說明五味子甲素可以一定程度上緩解IBD小鼠結腸腸動力，改善其收縮功能。同時，模型組小鼠結腸質量、結腸指數升高，脾指數升高，肉眼及鏡下觀察結腸損害嚴重，給予柳氮磺吡啶和五味子甲素組小鼠可顯著緩解上述癥狀。綜上所述，五味子甲素預防給藥對于炎性腸病小鼠有明顯的保護作用。

雖然本研究從臨床癥狀、結腸指數、結腸轉運時間、結腸組織病理損傷方面探討了五味子甲素對3% DSS誘導的小鼠炎性腸病的預防性作用，但仍需進一步探討其具體作用機制。隨著對其作用機制、作用靶點的不斷深入研究，五味子甲素或將成為治療炎性腸病的有效藥物之一。