細胞骨架對毫針針刺“足三里”調(diào)控穴區(qū)溫度、電阻和ATP/ADP的影響

張 婷，賴 清，陳 波，王 鼎，吳永強，周 媛，司原成，莫曦雅

(貴州中醫(yī)藥大學 針灸推拿學院，貴州 貴陽 550025)

毫針針刺是針灸防治疾病的常用手段，是醫(yī)者借助毫針在人體腧穴(或其它特定部位)施以一定的手法操作，從而達到疏通經(jīng)絡、調(diào)和氣血、扶正祛邪目的的一種中醫(yī)臨床外治方法。腧穴是由已知結(jié)構(gòu)立體構(gòu)筑所組成的綜合體[1]，是針刺作用的初始應答環(huán)節(jié)，也是針刺信號的信息轉(zhuǎn)換平臺，在針刺效應的轉(zhuǎn)換和啟動中具有重要作用。實驗針灸學研究確認毫針對機體的有效刺激本質(zhì)是機械刺激[2]。生物醫(yī)學工程細胞生物力學研究發(fā)現(xiàn)力學誘導細胞膜和胞內(nèi)某些蛋白分子的形變能將機械信號轉(zhuǎn)換成生物化學信號，啟動下游細胞信號通路的級聯(lián)反應[3-4]。課題組近年來研究發(fā)現(xiàn)細胞骨架微絲、微管能夠在針刺過程中應力發(fā)生變化向細胞內(nèi)傳遞機械力學信息[5-6]，但是細胞骨架結(jié)構(gòu)受破壞后是否影響正常針刺的效應，目前尚不清楚。因此，本研究選取生物熱學特性、電學特性和能量代謝特性三方面，重點探討細胞骨架中微絲和微管結(jié)構(gòu)完整與否對正常針刺的反應是否有其他影響，為進一步闡釋細胞骨架在針刺機理中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

6～8周齡SPF級SD雄性大鼠48只，體質(zhì)量(200±20)g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2019-0014。動物飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學動物實驗室，室溫(22±1)℃，相對濕度(50±5)%，光照12 h明暗交替(明期8：00-20：00)，大鼠自由攝食進水。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組、干擾微絲組和干擾微管組3組，每大組16只，各組再按窩別、體質(zhì)量、活躍度因素配對后隨機分為非針刺組與針刺組2個小組，每小組8只。所有實驗操作均嚴格遵守中華人民共和國科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要儀器與試劑

電子天平(WT型，杭州萬特衡器公司)；紅外體溫計(CK-T1503，深圳長坤科技公司)；直流低電阻測試儀(YP2512，深圳永鵬儀器公司)；凍存管(607001，美國NEST)；液氮罐(YDS-20，青島海爾特種電器公司)；酶標分析儀(Infinite F50，瑞士Tecan)；一次性無菌針灸針(0.30 mm×25 mm，吳江云龍醫(yī)療器械公司)。

秋水仙堿(MB1063-S，大連美侖生物技術公司)；細胞松弛素B(D8370-500ml，美國Apexbio)；二甲基亞砜(1121E0323，北京索萊寶科技公司)；水合氯醛(1113A20，北京雷根生物技術公司)；大鼠三磷酸/二磷酸腺苷ELISA試劑盒(ZK-R4622/ZK-R3711，深圳子科生物科技公司)。

1.3 干預方法

大鼠適應性喂養(yǎng)7天后進行干預。各組大鼠稱重后，于右側(cè)“足三里”穴周備皮，穴位定位參考《實驗針灸學》附錄四[7]，定位為：膝關節(jié)下外側(cè)，腓骨小頭下5 mm。各組大鼠稱重備皮后分別用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，麻醉劑量(mL)=大鼠質(zhì)量(g)×0.3 mL/100 g。

正常針刺組麻醉后消毒右側(cè)“足三里”穴，毫針直刺5 mm，按(60±2)r/min的頻率均勻捻針，捻轉(zhuǎn)幅度為180°～360°，捻針5 min，留針10 min，然后再捻針5 min，以此類推，共捻針3次，于第3次捻針完畢后出針，每天1次，共操作3天。正常非針刺組麻醉后與正常針刺組做相同的抓取、固定，不施加其他處理。干擾微絲針刺組麻醉后于右側(cè)“足三里”穴注射細胞松弛素B 300 μg，30 min后參照正常針刺組進行毫針針刺，每天注射和針刺各1次，共操作3天。干擾微絲非針刺組麻醉后于右側(cè)“足三里”穴注射細胞松弛素B 300 μg，每天1次，共操作3天。干擾微管針刺組麻醉后于右側(cè)“足三里”穴注射秋水仙堿250 μg，30 min后參照正常針刺組進行毫針針刺，每天注射和針刺各1次，共操作3天。干擾微管非針刺組麻醉后于右側(cè)“足三里”穴注射秋水仙堿250 μg，每天1次，共操作3天。

1.4 觀察指標與檢測方法

1.4.1 穴區(qū)溫度值 各針刺組大鼠行末次刺激后，俯臥位固定，(非針刺組將大鼠靜置，靜置時間與針刺組針刺時間相同)，用紅外體溫計溫度探頭置于穴區(qū)皮膚上3～5 cm處，每隔10 s記錄1次溫度值，記錄1 min，共記錄6次，取平均值為穴區(qū)溫度值。

1.4.2 穴區(qū)電阻值 溫度測量后，各組大鼠繼續(xù)俯臥位固定，以進針點為中心，在直徑5 mm范圍內(nèi)用75%酒精進行涂擦，無關電極蘸生理鹽水后，固定在右側(cè)后肢足掌中，并將蘸少許生理鹽水溶液的探測電極分別置于被測穴位進針點和其上下左右各1.5 mm 處共5個點觀測電阻，取平均值為穴區(qū)電阻值。

1.4.3 穴區(qū)ATP與ADP含量 于第3天檢測完溫度、電阻后，將大鼠脫頸處死并立即取材。取材方法為：于大鼠右側(cè)后肢進一步備皮、消毒，切開皮膚后，以大鼠針刺點為圓心，直徑約5 mm、垂直深度約5 mm的區(qū)域內(nèi)取穴區(qū)皮下組織塊約200 mg。組織塊取下后用生理鹽水沖洗，置入凍存管后于液氮中保存?zhèn)溆谩LISA法檢測組織塊ATP與ADP含量：組織勻漿后取上清液作為檢測標本，按照試劑盒說明書稀釋為6個濃度梯度，稀釋后各孔加樣量都為50 μL，設空白孔及樣品孔。每孔加入酶標試劑100 μL，空白孔除外，并用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。配液洗滌，每孔加滿洗滌液，靜置60 s后棄去，如此重復洗板5 次。顯色，加入底物A和B各50 μL，37 ℃避光顯色15 min，每孔加終止液50 μL，450 nm波長依序測量各孔的吸光度值，計算樣品含量。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)加減標準差表示。各組非針刺組與針刺組的組間數(shù)據(jù)采用配對t檢驗分析；組別間調(diào)節(jié)幅度采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠穴區(qū)溫度值比較

正常組、干擾微絲組、干擾微管組各組在針刺后，穴區(qū)局部溫度均較非針刺狀態(tài)降低(P<0.01)；干擾微絲組和干擾微管組較正常組，溫度調(diào)節(jié)幅度也均更大(P<0.01)。見表1。

表1 細胞骨架對正常生理狀態(tài)下毫針針刺調(diào)控穴區(qū)溫度的影響

2.2 各組大鼠穴區(qū)電阻值比較

正常組、干擾微絲組、干擾微管組各組在針刺后，穴區(qū)局部電阻均較非針刺狀態(tài)降低(P<0.01)；干擾微絲組較正常組，電阻調(diào)節(jié)幅度更大(P<0.01)；干擾微管組較正常組，電阻調(diào)節(jié)幅度無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 細胞骨架對正常生理狀態(tài)下毫針針刺調(diào)控穴區(qū)電阻的影響

2.3 各組大鼠穴區(qū)ATP/ADP比值比較

正常組、干擾微絲組在針刺后，穴區(qū)ATP/ADP比值較非針刺狀態(tài)升高(P<0.01)；干擾微管組針刺后，穴區(qū)ATP/ADP比值較非針刺狀態(tài)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；干擾微管組較正常組，穴區(qū)ATP/ADP調(diào)節(jié)幅度偏小(P<0.01)。見表3。

表3 細胞骨架對正常生理狀態(tài)下毫針針刺調(diào)控穴區(qū)ATP/ADP特性的影響

3 討論

細胞骨架是一種位于細胞核及細胞膜內(nèi)側(cè)面的纖維狀蛋白質(zhì)基質(zhì)，由微管、中間絲和微絲組成，廣泛存在于真核細胞內(nèi)，在維持細胞形態(tài)、承受外力、保持細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、參與細胞生命活動等方面起重要作用[8-9]。微管由α、β微管蛋白以二聚體形式頭尾相連聚合而成，是細胞骨架的架構(gòu)主干。微管的功能取決于其連續(xù)聚合和解聚的動力學性質(zhì)，秋水仙堿通過與微管蛋白異二聚體結(jié)合，促進了微管的降解進程[10-11]。微絲即肌動蛋白絲，是由肌動蛋白分子螺旋狀聚合成的絲狀肌動蛋白，集中分布于質(zhì)膜下，參與維持細胞形狀和賦予質(zhì)膜機械強度。細胞松弛素可阻止微絲快速生長端球狀肌動蛋白的添加，從而降低微絲聚合速率，使微絲網(wǎng)格結(jié)構(gòu)破壞[12-13]。中間絲又稱作中間纖維，由一個或多個不同的亞單位形成，使細胞具有張力和抗剪切力作用。使用去垢劑、高鹽溶液等抽提細胞后，中間纖維仍保持結(jié)構(gòu)的完整性，是最穩(wěn)定的細胞骨架成分[14]。

針刺能調(diào)節(jié)穴區(qū)溫度變化，是針刺調(diào)節(jié)被刺腧穴熱敏特性發(fā)生變化的外在表現(xiàn)[15]。有研究選取健康受試者的曲池穴行針刺刺激，發(fā)現(xiàn)針刺曲池穴即刻，曲池、溫溜、手三里穴的溫度下降，肘髎穴溫度升高，而在針刺曲池穴10 min后，曲池、肘髎穴溫度較針刺前升高，溫溜、手三里穴溫度低于針刺前水平[16]。這表明針刺對于穴區(qū)溫度有雙向調(diào)節(jié)作用，且受機體狀態(tài)、手法、針刺時間、刺激強度等因素影響[17-18]。本研究中所采用的針刺方法對于大鼠“足三里”穴具有明顯降溫作用，干擾微絲組和干擾微管組針刺后穴區(qū)溫度均較非針刺狀態(tài)也降低，且較正常組溫度調(diào)節(jié)幅度更大，說明微絲、微管完整與否對正常針刺的溫度調(diào)控有干擾作用。

經(jīng)穴的電學特性是指在生理病理不同機能狀態(tài)下，人體相關的經(jīng)穴組或耳穴群電阻、電容、電位甚至電感等的特異性。人體穴位存在電阻抗特性和伏安特性，穴位的電阻是不同組織的電阻之和，具有低電阻、高電位的特性[19]。一般情況下，針刺能進一步降低穴位電阻[20]，而本研究中，干擾微絲組、干擾微管組針刺后穴區(qū)電阻值均較非針刺狀態(tài)降低，干擾微管組較正常組電阻調(diào)節(jié)幅度無統(tǒng)計學差異，而干擾微絲組較正常組電阻調(diào)節(jié)幅度更大，說明細胞骨架微絲完整與否對正常針刺的電阻調(diào)控有干擾作用。

能量代謝指能量的釋放、轉(zhuǎn)移、存儲和利用。線粒體是細胞生命活動的控制中心，通過三羧酸循環(huán)生產(chǎn)維持細胞正常功能所需的ATP[21]。1分子ATP和1分子AMP可以催化反應生成2分子ADP[22]。ATP與ADP的比值，可以反應能量代謝水平，當ATP生成增多時，ATP/ADP比值升高，ATP水解增多時，則ATP/ADP比值下降。線粒體主要沿微管軌道運動，微絲則協(xié)助微管對線粒體進行短距離運輸[23]，細胞骨架對線粒體的形態(tài)和功能起調(diào)節(jié)作用[24]。本研究中，正常組針刺促進了穴區(qū)ATP/ADP比值的提高，但干擾微管組較正常組穴區(qū)ATP/ADP調(diào)節(jié)幅度減小，說明細胞骨架微管對正常針刺的能量代謝能產(chǎn)生明顯影響。

綜上，毫針針刺能降低穴區(qū)局部溫度與電阻，提高穴區(qū)局部能量代謝水平，而細胞骨架在毫針針刺調(diào)控穴區(qū)局部反應的作用中，微絲、微管對正常針刺的降溫效應均有影響，微絲對正常針刺的降電阻效應有影響，微管對正常針刺的升高能量代謝水平效應有影響，說明細胞骨架是影響針刺信息傳遞和調(diào)控針刺效應的重要途徑。今后，需研究在不同疾病狀態(tài)下研究細胞骨架對針刺效應的影響是否相同。