真武湯對(duì)高血壓小鼠血漿及腎組織ACE2的干預(yù)作用

周曉敏，朱紅俊，周春剛，徐 辰，高敬如，胡小海，姚元春，晏 涵

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院 心血管科，江蘇 無(wú)錫 214000)

原發(fā)性高血壓是臨床常見(jiàn)心血管疾病之一，2012-2015 年我國(guó)18歲及以上居民高血壓患病率達(dá)到27.9%[1]。研究表明，采用中西醫(yī)結(jié)合治療可有效降低原發(fā)性高血壓患者的血壓[2]，但是中醫(yī)藥的降壓機(jī)制不夠明確，需要探尋新的中醫(yī)藥治療思路以取得對(duì)原發(fā)性高血壓的根本性療效。有學(xué)者在學(xué)習(xí)和理解五運(yùn)六氣理論的基礎(chǔ)上，對(duì)脈象沉弦、沉緊的患者，采用真武湯等從太陽(yáng)寒水論治，取得了顯著的臨床效果[3]。文獻(xiàn)研究也證實(shí)，對(duì)氣虛血瘀、腎陽(yáng)虧虛型原發(fā)性高血壓伴舒張性心力衰竭患者，真武湯合桂枝茯苓湯具有良好的臨床療效[4]。由于真武湯治療高血壓作用機(jī)制的相關(guān)研究文獻(xiàn)較少，故本研究采用L-NAME(硝基精氨酸甲酯)誘導(dǎo)高血壓小鼠模型，以驗(yàn)證真武湯對(duì)高血壓的治療效果及對(duì)血漿ACE2水平的干預(yù)作用，現(xiàn)將研究情況報(bào)道如下。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL6雄性小鼠40只，周齡5周，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證編號(hào)：20170005022803。實(shí)驗(yàn)小鼠在江南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房飼養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2017-0052)。動(dòng)物房環(huán)境清潔，通風(fēng)設(shè)備良好，溫度保持在20～25 ℃，相對(duì)濕度50%。所有小鼠在同等條件下分籠飼養(yǎng)，12 h燈光晝夜交替，飲食、飲水自由。本實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審查號(hào)：JN.No20191230c1300630[373])，遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)指導(dǎo)原則。

1.2 藥物

普通標(biāo)準(zhǔn)飼料由江南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，真武湯灌胃藥劑由無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，處方組成及劑量根據(jù)《傷寒論》原方比例，1兩按照15 g計(jì)算，每劑含生白芍45 g、茯苓45 g、生白術(shù)30 g、生姜45 g、黑順片15 g，藥材從蘇州天靈中藥飲片有限公司購(gòu)入。水煎，每劑煎成2袋，每袋90 mL。貝那普利(北京諾華制藥有限公司，批號(hào)：X2872)由無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院藥房提供，10 mg/片，采用生理鹽水配置成0.2 mg/mL溶液。

1.3 儀器及試劑

主要儀器：酶標(biāo)儀(Bio Tek Instruments，USA)；離心機(jī)(Fresco17，Thermo Fisher公司)；Mrbp-mmc嚙齒動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)(美國(guó)，IITC Life Science)。主要試劑：L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)(美國(guó)，Sigma公司，貨號(hào)：N5751)；血漿ACE2水平Elisa試劑盒(美國(guó)，ABCAM公司，批號(hào)：GR3326353-1)；組織ACE2水平Elisa試劑盒(美國(guó)，RB公司，批號(hào)：DRE-M3394c)；組織腎素水平Elisa試劑盒(美國(guó)，RB公司，批號(hào)：DRE-M0560c)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 建模方法

高血壓小鼠模型建立及分組干預(yù)由江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。將購(gòu)買的40只雄性C57BL6小鼠(5周齡)預(yù)適應(yīng)1周后(按照SPF級(jí)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)適應(yīng)性喂養(yǎng))，隨機(jī)進(jìn)行分組標(biāo)號(hào)，分為空白對(duì)照組(WT)10只(空白組)和L-NAME模型建模組30只。空白組以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，并正常自由飲水。L-NAME模型組飲用添加 L-NAME含量為0.5 g/L的無(wú)菌水，誘導(dǎo)高血壓模型，2周后通過(guò)尾壓法檢測(cè)血壓是否達(dá)到高血壓標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)小鼠收縮壓維持在130 mmHg時(shí)，表明高血壓模型誘導(dǎo)成功。建模成功后繼續(xù)飲用添加 L-NAME含量為0.5 g/L的無(wú)菌水。

2.2 分組方法

隨機(jī)分為4組，分別為空白對(duì)照組(空白組)、模型對(duì)照組(模型組)、貝那普利干預(yù)組(貝那普利組)、真武湯干預(yù)組(真武湯組)，每組各10只。

2.3 給藥方法

真武湯組每只小鼠每天灌胃1次。根據(jù)體質(zhì)量換算，每20 g小鼠體質(zhì)量灌胃真武湯0.5 mL。貝那普利組每只小鼠每天灌胃貝那普利0.2 mg/mL水溶液一次，按照小鼠體質(zhì)量6 mg/kg給藥。

2.4 取材方法

各組連續(xù)灌胃2周，最后一次灌胃干預(yù)后，各組小鼠禁食、不禁水12 h，CO2麻醉并稱重后留取血漿及腎臟組織。心臟搏動(dòng)最強(qiáng)處取血，置于EDTA抗凝管中，離心后留取血漿，分管留存。各組小鼠均取1個(gè)完整腎臟組織，-80 ℃保存?zhèn)錂z。檢測(cè)時(shí)，首先將全自動(dòng)快速研磨儀的模塊和研磨珠放置于-20 ℃冰箱中冷卻。將預(yù)先稱重好的小鼠腎臟和3粒研磨珠置于無(wú) RNA 酶的2 mL離心管中，并加入預(yù)冷的1 mL PBS。將該離心管置于預(yù)冷的模塊中并在研磨儀上固定，設(shè)置參數(shù)為1 500轉(zhuǎn)/min，離心半徑5 cm，運(yùn)行20 s，間隔10 s，重復(fù)3次，得小鼠腎臟勻漿。然后于低溫離心機(jī)12 000 g/min，離心半徑5 cm，離心20 min，取上清液備用以檢測(cè)腎臟組織renin和ACE2水平。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

本研究通過(guò)尾袖法測(cè)量小鼠的收縮壓和舒張壓。使用了Mrbp-mmc嚙齒動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)(美國(guó)IITC Life Science)，每周檢測(cè)1次血壓。血漿ACE2水平、腎臟組織renin和ACE2水平采用Elisa方法測(cè)量，全部檢測(cè)在無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院心血管疾病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，采用酶標(biāo)儀測(cè)定。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 周齡增長(zhǎng)前后血壓與血漿ACE2水平的變化

小鼠隨年齡增長(zhǎng)收縮壓和舒張壓升高，ACE2水平下降。與第9周齡比較，29周齡小鼠的舒張壓升高、ACE2水平下降，變化幅度有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。而模型組小鼠的收縮壓、舒張壓持續(xù)升高，29周齡小鼠的收縮壓、舒張壓顯著高于基礎(chǔ)水平；血漿ACE2水平先升高后下降，最終低于基礎(chǔ)水平(P<0.001)和同齡空白組水平(P<0.05)。見(jiàn)表1、表2、表3。

表1 小鼠周齡增加時(shí)收縮壓的變化

表2 小鼠周齡增加時(shí)舒張壓的變化

表3 小鼠周齡增加時(shí)血漿ACE2水平的變化

3.2 真武湯對(duì)高血壓小鼠血壓和血漿ACE2水平的干預(yù)作用

干預(yù)后真武湯組、貝那普利組的收縮壓、舒張壓低于干預(yù)前，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。真武湯組ACE2水平略微高于干預(yù)前，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；貝那普利組的ACE2水平低于干預(yù)前，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表4、表5、表6。

干預(yù)后真武湯組、貝那普利組的收縮壓、舒張壓顯著低于模型組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；而ACE2水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4、表5、表6。

干預(yù)后，真武湯組收縮壓、舒張壓、血漿ACE2水平均高于貝那普利組。其中，兩組舒張壓、ACE2水平的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017；P<0.001)。見(jiàn)表4、表5、表6。

表4 真武湯對(duì)高血壓小鼠收縮壓的干預(yù)作用

表5 真武湯對(duì)高血壓小鼠舒張壓的干預(yù)作用

表6 真武湯對(duì)高血壓小鼠血漿ACE2水平的干預(yù)作用

3.3 真武湯對(duì)高血壓小鼠腎組織Renin、ACE2水平及其比值的干預(yù)作用

干預(yù)后真武湯組、貝那普利組腎臟組織中的renin和ACE2含量均低于模型組，其中renin及R/A比值的降低有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。真武湯對(duì)腎臟組織renin及R/A比值的降低作用顯著優(yōu)于貝那普利(P<0.01)。但是，真武湯和貝那普利對(duì)腎臟組織ACE2水平的降低，與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表7。

表7 真武湯對(duì)高血壓小鼠腎組織Renin、ACE2水平及其比值的干預(yù)作用

4 討論

根據(jù)中醫(yī)五運(yùn)六氣理論，世界由五種穩(wěn)定的勢(shì)態(tài)和六種變化的時(shí)態(tài)即五運(yùn)、六氣構(gòu)成[5]。《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問(wèn)·血?dú)庑沃酒吩疲骸胺蛉酥?shù)，太陽(yáng)常多血少氣，少陽(yáng)常少血多氣，陽(yáng)明常多氣多血，少陰常少血多氣，厥陰常多血少氣，太陰常多氣少血，此天之常數(shù)。”陰血多，則循環(huán)容量多，血壓高。陽(yáng)氣少則陽(yáng)氣溫煦不足而內(nèi)寒，寒主收引，經(jīng)脈弦緊，則血壓高。因此，我們將脈象沉弦、沉緊的高血壓歸為太陽(yáng)寒水型高血壓。真武湯可以有效治療此類高血壓[3]，但是真武湯降低血壓的機(jī)制尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)小鼠模型研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，對(duì)于L-NAME誘導(dǎo)的小鼠高血壓模型，真武湯在1～2周內(nèi)即可發(fā)揮降血壓的作用，這與一些學(xué)者的臨床經(jīng)驗(yàn)一致[3]，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，其作用機(jī)制可能和真武湯調(diào)節(jié)了血漿ACE2水平有關(guān)。

研究還發(fā)現(xiàn)，在L-NAME誘導(dǎo)小鼠血壓升高的過(guò)程中，小鼠血漿ACE2水平先升高后顯著下降。由于L-NAME是NO 合酶抑制劑，可以抑制內(nèi)源性NO 的產(chǎn)生[6]，造成內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致小鼠高血壓。而ACE2在腎素-血管緊張素系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，主要受到RAS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。ACE2在血壓調(diào)節(jié)方面的主要作用是將Ang II代謝為血管緊張素II(1-7)，擴(kuò)張血管，從而降低血壓[7]。因此，可以推測(cè)，L-NAME誘導(dǎo)小鼠血壓升高的過(guò)程中，血漿ACE2水平首先反應(yīng)性升高以對(duì)抗血壓升高的生理學(xué)過(guò)程；而后在持續(xù)誘導(dǎo)血壓升高的過(guò)程中，出現(xiàn)調(diào)節(jié)障礙最終導(dǎo)致血漿ACE2水平顯著下降，進(jìn)一步升高了小鼠的血壓水平。

本研究結(jié)果還顯示，真武湯可以恢復(fù)高血壓小鼠受損的血壓調(diào)節(jié)機(jī)能，升高血漿ACE2水平。對(duì)于L-NAME誘導(dǎo)的高血壓小鼠，真武湯升高血漿ACE2水平的能力要優(yōu)于貝那普利(1 459.27±141.2 ng/L VS 1 049.6±233.5 ng/L)。但是，貝那普利降低L-NAME誘導(dǎo)的高血壓血壓小鼠的舒張壓的能力要強(qiáng)于真武湯(72.8±2.5 mmHg VS 77.5±4.3 mmHg)。從這個(gè)角度說(shuō)，L-NAME誘導(dǎo)的高血壓小鼠的血壓水平和血漿ACE2水平雖然有負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，但不是完全平行。

ACEI的作用機(jī)制是通過(guò)阻斷ACE將AngⅠ水解為升高血壓的AngⅡ，從而降低血壓。研究表明，ACEI還可以升高ACE2的水平和活性，依那普利也可以增加心臟ACE2的表達(dá)[8]，ACEI治療也可增加糖尿病患者血清ACE2活性[9]。因此，貝那普利作為經(jīng)典的ACEI制劑，在本研究中升高高血壓小鼠的ACE2水平是可預(yù)期的結(jié)果；而真武湯升高血漿ACE2水平則缺乏文獻(xiàn)證明。本研究中，真武湯可以升高小鼠血漿ACE2水平，且升高幅度優(yōu)于貝那普利，從而降低了高血壓小鼠的血壓。

同時(shí)，對(duì)腎臟組織renin和ACE2水平的檢測(cè)表明，真武湯組的腎組織ACE2水平和模型組沒(méi)有差異，但是腎組織中的renin含量和R/A比值，真武湯要顯著低于模型組，也低于貝那普利組。有研究證實(shí)，醛固酮/腎素濃度比值對(duì)降低我國(guó)人群原發(fā)性醛固酮增多癥篩查中洗脫藥物的風(fēng)險(xiǎn)有幫助[10]。但是，本研究中真武湯和貝那普利在降低血壓的同時(shí)，雖然恢復(fù)了血漿降低的ACE2水平，但是并沒(méi)有能夠恢復(fù)L-NAME誘導(dǎo)的高血壓小鼠腎臟組織renin和ACE2水平。故推測(cè)，真武湯更可能是通過(guò)調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的血漿中的整體平衡關(guān)系來(lái)降低血壓的。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，采用真武湯辨證加減內(nèi)服治療維持性血液透析患者可維護(hù)殘余腎功能[11]，本研究結(jié)果可部分解釋其作用機(jī)制。而對(duì)芪蛭真武湯減少單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠的尿蛋白的機(jī)制研究則認(rèn)為與真武湯抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路和氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用有關(guān)[12]，這又提示了真武湯的多重作用機(jī)制。

綜上所述，真武湯對(duì)L-NAME誘導(dǎo)的小鼠高血壓模型具有良好的降血壓作用，其作用機(jī)制與真武湯升高血漿ACE2水平有關(guān)。