高效液相色譜一測多評法同時檢測藤黃健骨丸中7 種成分含量

趙昱瑋 南敏倫 司英奇 林宇琪 尹 涵 赫玉芳

1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心，吉林長春 130117；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院植物化學(xué)研究所，吉林長春 130012；3.吉林省奧普金鉆技術(shù)檢測服務(wù)有限公司檢測部，吉林長春 130507；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118；5.長春中醫(yī)藥大學(xué)健康管理學(xué)院，吉林長春 130117

藤黃健骨丸收載于中藥成方制劑第二十冊（WS3-B-4044-98）[1]，由淫羊藿、熟地黃、燙骨碎補(bǔ)、肉蓯蓉、鹿銜草、雞血藤、炒萊菔子等7 味組成，功能與主治為補(bǔ)腎，活血，止痛。既能強(qiáng)健骨骼，又能調(diào)理身體機(jī)能及促進(jìn)血液循環(huán)，對于身體的酸軟疼痛既具有養(yǎng)護(hù)作用，又能緩解關(guān)節(jié)疼痛。對增生所致的關(guān)節(jié)炎、脊椎炎、頸椎病、大骨節(jié)病等疾病具有明顯的療效。方中熟地黃既能滋陰補(bǔ)血，又能益精填髓為君藥[2-3]。淫羊藿補(bǔ)腎陽，祛風(fēng)濕[4-7]；肉蓯蓉補(bǔ)腎陽，益精血[8-9]。二藥共用補(bǔ)腎陽，輔助君藥，陰陽同補(bǔ)。骨碎補(bǔ)壯骨補(bǔ)腎，療傷止痛[10-11]；鹿銜草補(bǔ)虛腎、祛風(fēng)濕，強(qiáng)筋骨[12-13]，以上四味，輔助君藥補(bǔ)益腎，強(qiáng)筋骨為臣藥。雞血藤活血舒筋，通經(jīng)活絡(luò)為佐藥[14-15]。萊菔子消積、行氣，以防補(bǔ)而滋膩之弊，為使藥[16-18]。

一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）是通過測定一種有效的成分，實(shí)現(xiàn)多種成分同時測定的方法[19-20]，目前，未檢索到關(guān)于藤黃健骨丸QAMS 方面的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[21-28]。本研究采用QAMS，以淫羊藿苷為內(nèi)參物，建立了松果菊苷、麥角甾苷、柚皮苷、淫羊藿定A、淫羊藿定B、淫羊藿定C 的相對校正因子，利用相對校正因子計(jì)算藤黃健骨丸中松果菊苷、麥角甾苷、柚皮苷、淫羊藿定A、淫羊藿定B、淫羊藿定C 的含量，并與外標(biāo)法（external standard method，ESM）結(jié)果進(jìn)行比較，由此驗(yàn)證QAMS 的可行性與準(zhǔn)確性，為更好地對藤黃健骨丸進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量評價(jià)和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 型高效液相色譜儀（安捷倫）；AK-060SD 型超聲波清洗器（深圳市鈺潔清洗設(shè)備有限公司）；AX124ZH 型分析天平（奧豪斯儀器有限公司），PT-104/35S 型分析天平（福州華志科學(xué)儀器公司）。

1.2 試藥

純凈水，乙腈（色譜純，F(xiàn)isher），甲醇（分析純，20211225，廣東光華科技股份有限公司）。淫羊藿苷、淫羊藿定C、柚皮苷、松果菊苷、麥角甾苷對照品（批號 分 別 為110737-202017、111780-201905、110722-202116、111670-201907、111530- 201914；純度分別為98.1%、94.3%、93.5%、91.8%、95.2%；中檢院）。淫羊藿定A、淫羊藿定B（批號分別為RMT10654、RMT10655；純度分別為98.0%、948.0%）。藤黃健骨丸（批號分別為20200101、20200102、20200103、20200401、20200402、20200801、20200802、20210101、20210401、20210404、20210801，吉林吉春制藥股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX Extend C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）色譜柱；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：25℃；檢測波長：280 nm；流動相：0.1%磷酸溶液（B）-乙腈（A），流速：1.0ml/min，梯度洗脫：0～15min，8%→10%A；15～55min，10%→30%A；55～65 min，30%→45%A；65～75 min，45%A；75～90 min，45%→80%A。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取松果菊苷、麥角甾苷、柚皮苷、淫羊藿定A、淫羊藿定B、淫羊藿定C、淫羊藿苷對照品適量，置25 ml 量瓶中，以甲醇為溶劑，分別配制成濃度分別為0.463 7、0.566 4、0.530 9、0.454 7、0.571 3、0.517 7、0.514 0 mg/ml 的對照品儲備液；再分別精密吸取對照品儲備液3、1、1、0.2、0.5、1、2 ml 置于同一10 ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為0.139 11、0.056 64、0.053 09、0.009 09、0.028 57、0.051 77、0.102 80 mg/ml 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取藤黃健骨丸，剪碎，取約1 g，用分析天平精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，用分析天平稱定重量，置超聲波中處理（功率40 W，頻率250 kHz）30 min，放冷，再用分析天平稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 專屬性考察

取“2.2”項(xiàng)下2 種溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果各成分峰分離良好。見圖1。

圖1 各成分高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品的儲備溶液，加甲醇逐級稀釋成系列濃度，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1。可見，松果菊苷等7 種成分在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 對照品的線性方程

2.5 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)

取藤黃健骨丸（批號：20200103）制備供試品溶液，依法連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果7 種成分峰面積的RSD在0.9%～1.8%，表明儀器精密度良好；于0、4、8、12、24、48 h 依法進(jìn)行測定，結(jié)果7 種成分峰面積的RSD在1.3%～1.9%，表明溶液在室溫下48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。平行制備6 份供試品溶液，依法進(jìn)行測定，結(jié)果7 種成分峰面積的RSD 在0.4%～1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批藤黃健骨丸（批號：202001 03）6 份各約0.5 g，精密稱定，分別加入7 種成分對照品溶液，依法制備供試品溶液，進(jìn)行加樣回收率考察，7 種成分的平均回收率為97.70%～99.25%，RSD 為0.53%～1.57%。

2.7 相對校正因子的確定及重現(xiàn)性考察

2.7.1 相對校正因子的測定 記錄“2.2.1”項(xiàng)中混合對照品各成分的峰面積，松果菊苷、麥角甾苷、柚皮苷、淫羊藿定A、淫羊藿定B、淫羊藿定C 與內(nèi)參物淫羊藿苷之間的相對校正因子分別為1.495 5、1.570 2、0.522 8、0.289 7、1.107 5、0.991 1，RSD 分別為0.52%、0.68%、1.26%、1.84%、0.91%、1.27%。

2.7.2 相對校正因子的驗(yàn)證 試驗(yàn)中采用Agilent ZORBAX Extend、Diamonsil（鉆石）、Hypersil BDS 色譜柱，并采用Agilent 1200 和華譜S6000 色譜儀，對不同流速（0.9、1.0、1.1 ml/min）、不同柱溫（20、25、30℃）條件下各待測成分出峰時間的相對保留值（以淫羊藿苷為內(nèi)參物）進(jìn)行計(jì)算。以淫羊藿苷為內(nèi)標(biāo)，相對校正因子在不同色譜條件下其相對保留時間RSD 均<3.0%。

2.8 待測組分色譜峰定位

7 種成分與淫羊藿苷的相對保留時間分別為0.549、0.671、0.743、0.953、0.968、0.982、1.000，RSD 在0.95%～1.82%，表明可以對7 種成分色譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確定位。2.9 QAMS 與ESM 測定結(jié)果的比較

分別運(yùn)用ESM 和QAMS 法計(jì)算11 批藤黃健骨丸各組分的含量，計(jì)算公式為Ci=fs/i×Cs×Ai/As（其中，Ai為待測組分的峰面積，As為淫羊藿苷峰面積，Cs為淫羊藿苷濃度，Ci為待測組分的濃度，fs/i 為淫羊藿苷對待測組分的校正因子），結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，兩種方法無明顯差異，RSD 均＜5.0%，表明本研究所建立的fs/i 準(zhǔn)確可靠，可直接用于測定藤黃健骨丸中7 種成分的含量。

表3 QAMS 與ESM 測定藤黃健骨丸中7 種成分的含量（mg/g）

3 討論

已有文獻(xiàn)報(bào)道了藤黃健骨丸含量測定指標(biāo)及測定方法，但所測定的均為同種藥材中的指標(biāo)，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道同時對處方中多種藥材中的指標(biāo)性成分進(jìn)行測定。本研究建立了本處方中淫羊藿、熟地黃、骨碎補(bǔ)、熟地黃等多種藥材中的指標(biāo)成分的測定方法，采用HPLC 法同時測定了7 種成分的含量，能更加系統(tǒng)、全面地反映藥品藤黃健骨丸的質(zhì)量。

分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相，結(jié)果乙腈-0.1%磷酸溶液的梯度洗脫系統(tǒng)，分離度較好。考察了3 種不同C18色譜柱，按照分離效果，最終選定了Agilent ZORBAX Extend C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱。通過多個波長的考察，結(jié)果在280 nm 時，各峰比例適中。

本研究首次建立了藤黃健骨丸中7 種成分的QAMS。選用淫羊藿中淫羊藿苷作為內(nèi)參物，建立的相對校正因子具有較好的可信度，QAMS 與ESM 測得的結(jié)果無明顯差異，提示QAMS 可以作為一種簡單、準(zhǔn)確的方法可應(yīng)用于藤黃健骨丸多組分的含量測定。