不同生長模式早產兒血清代謝組學分析

陳 瑩 王玉美 徐文英 張佩瀅

1.揚州大學醫學院附屬淮安市婦幼保健院兒童保健科，江蘇淮安 223002；2.揚州大學醫學院附屬淮安市婦幼保健院新生兒疾病篩查科，江蘇淮安 223002

隨著新生兒重癥監護技術的迅速發展，早產兒的生存率逐年提高，但多種因素導致早產兒，特別是極低出生體重兒宮外無法達到宮內的生長速度[1-2]，早期的營養累積不足成為今后生長缺陷及神經發育落后的主要原因[3-4]。對早產兒及低出生體重兒生長發育的縱向研究發現，大多數早產兒在出生后幾個月至1 歲期間均存在不同程度的追趕生長，尤其是生后6 個月[5]。對于適宜追趕生長的定義，國內外尚無統一的標準，目前建議將小于胎齡早產兒>第10 百分位，適于胎齡早產兒的體重、身長及頭圍達到校正年齡的第25～50 百分位定義為追趕生長滿意[6]。亦有文獻以Z 評分差異≥0.67 定義為出現追趕生長[7-9]。本研究以校正月齡6 月齡與出生體重Z 評分差值進行分組，應用液相色譜-串聯質譜聯用（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術進行代謝組學分析，尋找不同生長模式下的早產兒血清代謝物及代謝通路的差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019 年3 月至2020 年12 月揚州大學醫學院附屬淮安市婦幼保健院重癥監護病房住院且兒童保健科門診隨訪至校正月齡6 月齡的55 例早產兒，其中男30 例，女25 例；出生胎齡27+3～33+6周；出生體重0.95～2.73 kg。按校正胎齡6 月齡時體重是否發生追趕生長將其分為兩組，追趕生長組（35 例），△Z 評分（校正胎齡6 月齡時體重的Z 評分-出生時體重的Z 評分）≥0.67；無追趕生長組（20 例），△Z 評分（校正月齡6 月齡時體重的Z 評分-出生時體重的Z 評分）＜0.67。納入標準：①出生胎齡27～＜34 周；②生后24 h 內入院；③出院后在兒童保健科門診定期隨訪。排除標準：①患有先天畸形和遺傳代謝病；②患有青紫型先天性心臟病或伴有心功能不全；③母親患有嚴重內分泌及代謝性疾病；④研究過程中出現嚴重疾病（如膿毒癥、壞死性小腸結腸炎、嚴重代謝紊亂等）或死亡。本研究經醫院倫理委員會批準（2019063），且樣本采集獲得早產兒家屬的知情同意。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 主要儀器 超高效液相儀（Vanquish）、高分辨質譜儀（Q Exactive HFX）、離心機（Heraeus Fresco17）購于美國Thermo Fisher Scientific；天平（BSA124S-CW）購于德國Sartorius；純水儀（明澈D24 UV）購于德國Merck Millipore；超聲儀（PS-60AL）購于深圳市雷德邦電子有限公司。

1.2.2 實驗試劑 實驗用LC-MS 級純度的甲醇（X4730 432）、乙腈（Y7060432）、乙酸銨（BCCG1298）和氨水（7218060）由德國CNW Technologies 提供。

1.3 血清LC-MS/MS 檢測

1.3.1 提取代謝物 采集兩組早產兒血清2 ml 置于-80℃保存，按樣品∶提取液（甲醇、乙腈等體積混合）=1∶4（V/V）混合，加入同位素內標，渦旋超聲，40℃靜置1 h 后4℃離心，12 000 r/min 離心15 min，收集上清，為待測定標本，另取所有樣品等量上清混合，為質量控制標本，分別上機進行檢測。

1.3.2 分離、檢測標本 使用Vanquish（Thermo Fisher Scientific）超高效液相色譜儀和Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）液相色譜柱對目標化合物進行色譜分離。液相色譜：A 相為水相（含25 mmol/L 乙酸銨和25 mmol/L 氨水），B 相為乙腈。梯度洗脫：0～0.5 min，95% B；0.5～7.0 min，95%→65%B；7.0～8.0 min，65%→40%B；8.0～9.0 min，40%B；9.0～9.1 min，40%→95%B；9.1～12.0 min，95%B。流速：0.5 ml/min，柱溫：30℃，樣品盤溫度：4℃，進樣體積3 μl。質譜參數：Spray voltage：+3.5 kV/-3.2 kV；Sheath gas flow rate：50 arb，Aux gas flow rate：10 arb；Capillary Temp：320℃；Full MS resolution：60 000，MS/MS resolution：7500，Collision energy：10/30/60 in NCE mode。

1.3.3 差異代謝物鑒定 血清樣本采用LC-MS/MS 技術，在正離子模式下進行代謝組學分析，從原始數據中提取了6 210 個峰，經過數據預處理后，仍剩下4 788 個峰。原始數據經Proteo Wizard 軟件轉換后，通過自主編寫的R 程序包進行峰識別、提取和積分處理。建立主成分分析和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projections to latent structures-discriminant，OPLS-DA），數據與BiotreeDB（V2.1）自建二級質譜數據庫匹配并進行物質注釋（cut-off 值設為0.3）。差異代謝物篩選篩選條件：變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）＞1，且P ＜0.05。

1.3.4 差異代謝物相關通路分析 通過富集分析和拓撲分析對差異代謝物所在通路進行綜合分析，篩選出與代謝物差異相關性最顯著的關鍵通路。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料用均數±標準差（）表示，比較采用t檢驗；不符合正態分布的改用中位數（M），四分位間距（Q）表示，比較采用Mann-Whiteney U 檢驗。計數資料用例數表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較

兩組性別及出生胎齡、體重、身長、頭圍比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；兩組△Z 評分比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 血清代謝組學檢測與主成分分析質量控制

2.2.1 主成分分析 主成分分析顯示，質量控制基本聚在一起，樣本都在95%CI 內，整個分析過程穩定可靠、重復性良好，所得數據可用于下一步多元統計分析。見圖1。

圖1 主成分分析散點圖

2.2.2 OPLS-DA 分析 OPLS-DA 得到的分散點圖顯示，兩組代謝輪廓呈明顯聚類趨勢，說明兩組早產兒代謝模式有所不同。見圖2。

圖2 正交偏最小二乘法分析散點圖

2.2.3 OPLS-DA 置換檢驗 所得數據結果經200 次置換驗證得到R2Y、Q2截距分別為0.65、-0.3，說明原模型具有良好的穩健性，不存在過擬合現象。見圖3。

圖3 正交偏最小二乘法分析的200 次響應排序檢驗

2.3 血清差異代謝物

火山圖顯示，與追趕生長組比較，無追趕生長組大多數代謝物在血清中上調，少部分代謝物在血清中下調，見圖4。共鑒定出244 種不同的代謝物，其中223 種表達上調，21 種下調。在人類代謝組數據庫中進行檢索鑒定，剔除未知代謝物，共得到28 種主要差異代謝物，見表2。其中上調物質27 種，主要為氨基酸類、甘油磷脂類、有機雜環化合物等；下調物質1 種，屬脂肪酸類。

圖4 火山圖

2.4 差異代謝物相關通路分析

本研究共發現14 條關鍵代謝物途徑，依據拓撲分析中的影響因子>0，以及代謝途徑的生物學作用，共篩選出10 條富集程度顯著的代謝通路，分別為精氨酸和脯氨酸代謝，谷胱甘肽代謝，氨基酰-tRNA 的合成，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，硫胺素新陳代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，組氨酸代謝，苯丙氨酸代謝及賴氨酸降解代謝，其中涉及氨基酸代謝的有9 條。見圖5。

圖5 通路分析圖

3 討論

早產兒由于各系統發育不成熟，易引起機體內激素分泌紊亂，如果能闡述早產兒某一時刻的代謝組學特點，對早產兒疾病的營養支持及早期識別有很大幫助[10-12]。出院時為適于胎齡的早產兒，或在6 個月內出現并完成追趕生長的早產兒，生長和神經發育結局較好[13]。因此，研究早產兒的不同追趕生長模式，尤其是生后6 個月的生長模式對早產兒生存質量及遠期預后至關重要。代謝組學通過篩選、研究疾病相關生物標志物，對疾病的早期診斷和預后提供依據，揭示了飲食或營養干預下機體的代謝變化[14-16]。

本研究結果顯示，不同生長模式早產兒的血清代謝輪廓存在的差異，且有分類趨勢，血清差異代謝物通路主要集中在氨基酸的代謝與合成中。提示早產兒的氨基酸代謝過程和生理功能與其生長發育發生密切相關[17]，其中富集程度最顯著的代謝通路為精氨酸和脯氨酸代謝及谷胱甘肽代謝。研究顯示，精氨酸代謝與營養在生長、健康和疾病有關[18-19]，谷氨酰胺和谷氨酸轉運體異常活動與胎兒生長受限及胎盤功能障礙有聯系[20]，精氨酸和脯氨酸代謝及谷胱甘肽代謝與人類的生長發育、營養等密切相關。本研究結果顯示，有27 種血清差異代謝物在無追趕生長早產兒中上調，其中8 種為氨基酸類。研究表明，早產兒早期存在追趕性生長，對氨基酸的利用率增高[21-22]，所以體重增長正常的早產兒體內部分氨基酸相對含量較體重增長緩慢早產兒降低，而體重增長緩慢早產兒由于新陳代謝較慢或代謝通路障礙，對這些氨基酸的利用率下降，所以部分氨基酸相對含量較體重增長正常早產兒升高，本研究結果與其相似。早產兒早期給予含氨基酸的營養支持，可減少蛋白質分解，增加蛋白質合成，促進正氮平衡及肌肉和骨骼的生長，促進早產兒的生長發育[23-24]。不同生長模式的早產兒，其血清代謝物存在差異，6 月齡內追趕生長良好的早產兒更容易出現氨基酸缺乏。因此，臨床醫生需重視早產兒早期的營養支持，尤其是氨基酸補充。本研究結果顯示，無追趕生長早產兒的血清癸酰肉堿水平顯著下調，可能其自身疾病及營養攝入不足，導致肉堿攝入更加不足有關。劉丹陽等[25]提出早產兒生后早期肉堿水平降低（完全腸外營養時幾乎無肉堿攝入），即使逐漸增加母乳或配方奶喂養，多數酰基肉堿水平仍呈下降趨勢，說明早產兒生后早期的肉堿攝入不足可影響其后期的生長發育和營養狀況。因此，建議對早期腸外營養支持的新生兒應預防性補充肉堿。

本研究利用LC-MS/MS 技術，對不同生長模式早產兒的血清進行代謝組學檢測分析，發現在校正胎齡6 月齡時追趕生長與無追趕生長的早產兒血清代謝物有差異，其差異顯著的代謝通路以氨基酸代謝為主，這一研究結果為早產兒生后早期營養支持尤其是必需氨基酸的合理補充及促進早產兒順利完成追趕生長提供了理論依據。本研究篩選到1 個在無追趕生長早產兒的血清中顯著下調的小分子代謝物——癸酰肉堿，為以后從脂肪酸和能量代謝方面研究早產兒追趕生長提供了新的研究思路。