細胞色素P450 2E1穩定轉染Flp-InTM CHO細胞模型的建立*

趙永龍， 郭瑋鈺， 龍昌蘭， 陸定艷， 陳帥帥， 李勇軍， 劉亭**

(1.貴州醫科大學 藥學院， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室 & 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室, 貴州 貴陽 550004)

細胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)是生物體內主要的代謝酶之一，在內外源性有毒物質的代謝中發揮重要作用[1-3]，CYP包括CYP1、CYP2和CYP3家族。細胞色素P450家族2亞家族E成員1(cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1，CYP2E1)是CYP2家族成員之一，其基因位于人類的10號染色體，含有9個外顯子和8個內含子，共有11 413個堿基對[4-8]。CYP2E1主要分布在肝臟，占肝臟CYP總量的7%，其代謝底物多達90余種，其中大部分為藥物、工業毒物和前致癌物等小分子化合物[9]，是肝臟的重要代謝酶之一[9-12]。研究表明，CYP2E1基因介導的氧化應激反應與肝癌侵襲轉移有關[13-15]，對CYP2E1酶的研究可為闡明其與底物的相互作用、疾病的預防治療及臨床合理用藥提供重要依據。體外構建高表達CYP2E1的基因模型，可用來進行細胞毒性的篩選，是研究CYP2E1的重要工具。鑒于此，本研究擬利用Lipofectamine?2000轉染試劑將pcDNA5-CYP2E1重組質粒與pOG44輔助質粒共同轉染至Flp-InTMCHO細胞，采用潮霉素B篩選穩定細胞株[17]，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)檢測目的基因CYP2E1的插入情況，實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測細胞中CYP2E1 mRNA和蛋白表達水平，并檢測 CYP2E1酶對對乙酰氨基酚(paracetamol, APAP)的毒性敏感性，從而確定模型是否成功建立，為體外研究CYP2E1提供工具。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞與載體 Flp-InTMCHO細胞株、pcDNA5/FRT載體由浙江大學陳樞青教授贈送，輔助質粒pOG44、重組表達載體pcDNA5/FRT-CYP2E1由北京博邁德基因技術有限公司合成。……