細胞色素P450 2E1穩定轉染Flp-InTM CHO細胞模型的建立*

趙永龍， 郭瑋鈺， 龍昌蘭， 陸定艷， 陳帥帥， 李勇軍， 劉亭**

(1.貴州醫科大學 藥學院， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室 & 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室, 貴州 貴陽 550004)

細胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)是生物體內主要的代謝酶之一，在內外源性有毒物質的代謝中發揮重要作用[1-3]，CYP包括CYP1、CYP2和CYP3家族。細胞色素P450家族2亞家族E成員1(cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1，CYP2E1)是CYP2家族成員之一，其基因位于人類的10號染色體，含有9個外顯子和8個內含子，共有11 413個堿基對[4-8]。CYP2E1主要分布在肝臟，占肝臟CYP總量的7%，其代謝底物多達90余種，其中大部分為藥物、工業毒物和前致癌物等小分子化合物[9]，是肝臟的重要代謝酶之一[9-12]。研究表明，CYP2E1基因介導的氧化應激反應與肝癌侵襲轉移有關[13-15]，對CYP2E1酶的研究可為闡明其與底物的相互作用、疾病的預防治療及臨床合理用藥提供重要依據。體外構建高表達CYP2E1的基因模型，可用來進行細胞毒性的篩選，是研究CYP2E1的重要工具。鑒于此，本研究擬利用Lipofectamine?2000轉染試劑將pcDNA5-CYP2E1重組質粒與pOG44輔助質粒共同轉染至Flp-InTMCHO細胞，采用潮霉素B篩選穩定細胞株[17]，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)檢測目的基因CYP2E1的插入情況，實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測細胞中CYP2E1 mRNA和蛋白表達水平，并檢測 CYP2E1酶對對乙酰氨基酚(paracetamol, APAP)的毒性敏感性，從而確定模型是否成功建立，為體外研究CYP2E1提供工具。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞與載體 Flp-InTMCHO細胞株、pcDNA5/FRT載體由浙江大學陳樞青教授贈送，輔助質粒pOG44、重組表達載體pcDNA5/FRT-CYP2E1由北京博邁德基因技術有限公司合成。

1.1.2主要試劑與儀器 F12培養基、胰蛋白酶購自美國gibco公司，胎牛血清(FBS)購自武漢Procell公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)、甘氨酸(Glycine)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、牛血清白蛋白(BSA)、Tris-base和APAP均購自北京索萊寶科技有限公司，MTS 購自promega公司，Ezup柱狀動物基因組DNA抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自上海生工?sangon Biotech公司，PrimeScriptTMART Master Mix(Perfect Real Time)逆轉錄試劑盒、總RNA提取試劑盒購自日本TAKARA公司，轉染試劑Lipofectamine?2000、潮霉素B購自美國Invitrogen公司，苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白裂解液(RIPA)購自大連美倫生物科技有限公司，SDS-蛋白預染Maker購自上海愛必信生物科技有限公司，PVDF膜購自德國Millipore公司，甲醇購自國藥集團化學試劑有限公司，ECL顯影液購自上海碧云天生物科技公司，小鼠抗β肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體、兔抗CYP2E1 抗體購自英國Abcam公司。PCR引物由上海恒英公司合成，引物序列：CYP2E1上游為5′-GTGATGCACGGCTACAAGG-3′，下游為5′-GGGTGGTCAGGGAAAACCG -3′；GAPDH上游為5′-CATCATCTCCGCCCCTTCTG-3′，下游為5′-CATGGACCGTGGTCATGAGT-3′。； TS-2脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，JJ-CJ-2ND Ⅱ超凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)，fresco17冷凍高速離心機(美國Thermo公司)，N50核酸蛋白檢測儀(德國IMPLEN公司)，CFX96熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，S1000 PCR擴增儀(美國Thermo公司)，PowerPac Basic電泳儀(美國Bio-Rad公司)，Trans-Blot Turbo半干轉膜儀(美國Bio-Rad公司)，BLOCOL-02層析實驗冷柜(北京博醫康實驗儀器有限公司)，TS100型熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，GBOXChemiXL1.4凝膠成像系統(英國Syngene公司)，311型CO2飽和濕度培養箱(美國Thermo scientific 公司)、YXQ-LS-50S II高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業有限公司醫療儀器廠)。

1.2 研究方法

1.2.1Flp-InTMCHO細胞的培養 用含10%胎牛血清的F12培養基，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養4～5 h，觀察細胞貼壁情況并換液。待細胞密度達到80%時，用胰蛋白酶消化后按比例1 ∶3進行傳代。

1.2.2Flp-InTMCHO-CYP2E1細胞株的構建 取生長狀態良好并處于對數生長期的Flp-InTMCHO細胞，用胰蛋白酶消化后，按照每孔2 mL的體積，以1.5×108個/L的密度將Flp-InTMCHO細胞接種于6孔板，37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中進行培養，當細胞密度達到60%時，進行轉染。用pcDNA5/FRT-CYP2E1質粒(0.25 μg)及輔助質粒pOG44 (2.25 μg)與Lipofectamine 2000 (8 μL)混合液轉染細胞48 h，用濃度為500 mg/L的潮霉素B進行穩定株篩選，每隔48 h換液1次。篩選14 d，以pcDNA5/FRT空質粒細胞作為陰性對照，對篩選出來的克隆進行基因組、mRNA和蛋白質層面的驗證。

1.2.3CYP2E1基因組PCR檢測 參照Ezup柱狀動物基因組DNA抽提試劑盒的方法，提取“1.2.2”項方法構建的未轉染的Flp-InTMCHO空白細胞、轉染空質粒的Flp-InTMCHO空質粒細胞、轉染CYP2E1的Flp-InTMCHO細胞(Flp-InTMCHO-CYP2E1)的gDNA (genomic DNA，基因組DNA)。以Flp-In、GAPDH、CYP2E1的DNA為模板進行PCR擴增，反應體系： TaKaRa Ex Taq 0.25 μL、10×Ex Taq Buffer 5 μL、dNTP Mixture 4 μL，gDNA450 ng，CYP2E1上下游引物各1.5 μL，最后加入無核酸酶水至50 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s，94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸(FLP-In引物3 min、CYP2E1引物30 s、GAP引物30 s， 40個循環)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，電泳電壓70 V，時間60 min。

1.2.4CYP2E1 mRNA表達水平檢測 參照總RNA提取試劑盒說明書提取各組細胞的總RNA，利用PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。反應體系： cDNA 2 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL， TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，加無核酸酶水至25 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min， 95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s， 40個循環。以GAPDH為內參，通過2-ΔΔCt法進行數據分析。

1.2.5CYP2E1蛋白表達水平檢測 采用RIPA裂解液提取各組細胞的總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，每組取變性后蛋白20 μg進行SDS-PAGE；恒壓25 V轉膜30 min，將蛋白轉移至PVDF膜，BSA封閉3 h，加入一抗(兔抗CYP2E1多克隆抗體，稀釋度1 ∶1 000；小鼠抗GAPDH單克隆抗體，稀釋度1 ∶5 000)，4 ℃孵育過夜；1× TBST洗膜5次，每次5 min，加入二抗(稀釋度1 ∶2 000)室溫孵育2 h；1 ×TBST洗膜5次，每次5 min；再將ECL Plus超敏發光液均勻滴加在PVDF膜上，凝膠成像儀顯影曝光，用Image Lab軟件分析灰度值，以目的蛋白與內參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.2.6APAP細胞毒性檢測 培養細胞至90%匯合，以1×108個/L接種于96孔板，每孔100 μL。培養24 h后，將細胞分為空白組和實驗組。空白組加入0.1%(體積分數)DMSO的完全培養基，各實驗組分別給予APAP(100、200、400、800 及1 000 μmol/L)處理24 h，棄掉原培養基，加入含5%(體積分數)MTS的F12培養基100 μL孵育2 h，在490 nm處的測定吸光度(OD)值，計算細胞存活率[存活率(%)=(A實驗-A培養基/A空白-A培養基)×100%]，實驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 PCR檢測細胞中CYP2E1的插入情況

結果如圖1所示，GAPDH引物擴增的Flp-InTMCHO空白細胞、Flp-InTMCHO空質粒細胞和Flp-InTMCHO-CYP2E1細胞的條帶亮度基本一致，說明提取的總DNA幾乎無降解，Flp-In引物和CYP2E1引物擴增的Flp-InTMCHO-CYP2E1細胞分別在2 000 bp、200 bp左右有明顯條帶，提示CYP2E1基因已成功轉入Flp-inTM-CHO細胞。

注：1為Marker，2、5、8為Flp-InTM CHO空白組，3、6、9為Flp-InTM CHO空質粒組，4、7、10為Flp-InTM CHO-CYP2E1組。圖1 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性

如圖2所示，所提取的RNA條帶不存在拖尾現象，28 s條帶的亮度明顯是18 s條帶的2倍左右，說明提取的總RNA幾乎無降解，RNA的完整性符合本研究的要求。

注：A為Flp-InTM CHO組，B為 Flp-InTM CHO空質粒組，C為Flp-InTM CHO-CYP2E1組。圖2 RNA完整性檢測的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.2 Results of RNA integrity electrophoresis

2.3 核酸蛋白檢測儀檢測RNA濃度

從表1可以看出，本研究RNA樣品的濃度均>200 mg/L， OD260/OD280平均比值在1.8～2.2，說明所提取的RNA純度滿足本研究的實驗要求。

表1 RNA的濃度及OD260/OD280比值Tab.1 RNA concentration and OD260/OD280 ratio

2.4 細胞中CYP2E1 mRNA和蛋白表達水平

如圖3所示，與Flp-InTMCHO空質粒組比較，Flp-InTMCHO-CYP2E1組CYP2E1的mRNA表達水平明顯增加，差異有統計學意義(P<0.001)；相對應的CYP2E1蛋白表達結果顯示，與Flp-InTMCHO空質粒組比較，Flp-InTMCHO-CYP2E1組CYP2E1蛋白表達水平也明顯增加，差異有統計學意義(P<0.001)。

注：A為CYP2E1 mRNA水平的定量結果，B、C分別為CYP2E1蛋白表達及定量結果；(1)與Flp-InTM CHO空質粒組相比，P<0.01。圖3 細胞中CYP2E1 mRNA和蛋白表達水平Fig.3 Expression level of CYP2E1 mRNA and protein in the cells

2.5 APAP細胞毒性檢測

如圖4所示，Flp-InTMCHO細胞和Flp-InTMCHO-空質粒細胞的給藥組與0 μmol/L 組比較，不同濃度的APAP對細胞存活率沒有明顯影響。當Flp-InTMCHO-CYP2E1細胞與不同濃度的APAP共孵育后，其細胞的存活率呈濃度依賴性降低，且差異具有統計學意義(P<0.05或<0.01)。

注：與0 μmol/L APAP組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖4 不同濃度APAP對細胞存活率的影響Fig.4 Effects of APAP at different concentrations on cell survival

3 討論

CYP家族廣泛參與生物體內的代謝過程，主要在肝臟細胞中進行表達，是肝臟中進行藥物代謝的關鍵酶之一。其中CYP2E1參與了90多種外源性藥物、內源性脂肪酸[18]和內源性毒物的代謝，包括硬脂酸、乙醇、四氯化碳[19]、月桂酸等[20]。

CHO細胞為中國倉鼠卵巢細胞，該細胞本身不含人源CYP酶，因此，在轉入CYP基因進行表達時，可以排除其他CYP酶的影響。Flp-InTMCHO細胞基因組是通過引入Flp重組酶的作用靶點(FRT)，讓目的基因在重組酶的介導下發生定點整合，使得目的基因整合到特定FPT位點，從而使轉染的目的基因轉錄和翻譯[19]。該細胞株構建細胞系具有目的蛋白表達均一穩定的優點[21-22]。

穩定轉染方法分為病毒法和非病毒法，其中病毒法的實驗環境要求較高，且后續需要進行單克隆篩選，步驟繁瑣且耗時長[22]。而非病毒法中最常用的有磷酸鈣沉淀法、電穿孔法以及脂質體介導法，通過抗生素篩選即可得到穩定細胞系，具有耗時短、工作量少等特點[23]。其中磷酸鈣沉淀法容易受pH的影響；電穿孔法會損傷細胞膜，且貼壁細胞較難操作；脂質體法是利用脂質體試劑在水相中與DNA形成DNA-陽離子脂質體復合物，導入至Flp-InTMCHO細胞，該轉染方法具有操作方便、重現性好和高效穩定的特點[24-25]。因此，本研究選擇非病毒法中的脂質體法介導轉染pcDNA5/FRT-CYP2E1質粒至Flp-InTMCHO細胞，構建能夠穩定表達CYP2E1酶的Flp-InTMCHO-CYP2E1細胞株模型。

本研究首先采用潮霉素B篩選穩定的Flp-InTMCHO-CYP2E1細胞株[17]，然后PCR檢測目的基因CYP2E1的插入情況，結果顯示Flp-InTMCHO-CYP2E1細胞分別在2 000 bp、200 bp左右有CYP2E1酶目的基因的明顯條帶。另外，進一步用qRT-PCR和 Western blot檢測細胞中CYP2E1 mRNA和蛋白表達水平，發現Flp-InTMCHO-CYP2E1細胞的CYP2E1 mRNA和蛋白表達水平均明顯增加(P<0.001)。最后，采用APAP檢測CYP2E1酶對APAP的毒性敏感性，結果也表明能夠穩定表達CYP2E1酶的Flp-InTMCHO細胞對APAP的毒性敏感性也顯著增強。

綜上所述，本研究成功建立了Flp-InTMCHO-CYP2E1細胞模型，該細胞能夠穩定表達CYP2E1酶，這將為后續研究CYP2E1與底物及疾病間的相互作用提供有力工具。課題組目前正在使用該細胞模型，來篩選能被CYP2E1代謝活化產生細胞毒性的藥物, 但目前還尚未篩選到相應藥物。