趙永龍, 郭瑋鈺, 龍昌蘭, 陸定艷, 陳帥帥, 李勇軍, 劉亭**
(1.貴州醫科大學 藥學院, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心, 貴州 貴陽 550004; 3.貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室 & 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室, 貴州 貴陽 550004)
細胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)是生物體內主要的代謝酶之一,在內外源性有毒物質的代謝中發揮重要作用[1-3],CYP包括CYP1、CYP2和CYP3家族。細胞色素P450家族2亞家族E成員1(cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1,CYP2E1)是CYP2家族成員之一,其基因位于人類的10號染色體,含有9個外顯子和8個內含子,共有11 413個堿基對[4-8]。CYP2E1主要分布在肝臟,占肝臟CYP總量的7%,其代謝底物多達90余種,其中大部分為藥物、工業毒物和前致癌物等小分子化合物[9],是肝臟的重要代謝酶之一[9-12]。研究表明,CYP2E1基因介導的氧化應激反應與肝癌侵襲轉移有關[13-15],對CYP2E1酶的研究可為闡明其與底物的相互作用、疾病的預防治療及臨床合理用藥提供重要依據。體外構建高表達CYP2E1的基因模型,可用來進行細胞毒性的篩選,是研究CYP2E1的重要工具。鑒于此,本研究擬利用Lipofectamine?2000轉染試劑將pcDNA5-CYP2E1重組質粒與pOG44輔助質粒共同轉染至Flp-InTMCHO細胞,采用潮霉素B篩選穩定細胞株[17],聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)檢測目的基因CYP2E1的插入情況,實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測細胞中CYP2E1 mRNA和蛋白表達水平,并檢測 CYP2E1酶對對乙酰氨基酚(paracetamol, APAP)的毒性敏感性,從而確定模型是否成功建立,為體外研究CYP2E1提供工具。
1.1.1細胞與載體 Flp-InTMCHO細胞株、pcDNA5/FRT載體由浙江大學陳樞青教授贈送,輔助質粒pOG44、重組表達載體pcDNA5/FRT-CYP2E1由北京博邁德基因技術有限公司合成。……