外泌體microRNA對缺血性腦卒中調控機制的研究進展

蘇梓健，詹晨陽，張 婷，韋佩祺，向軍軍綜述，胡躍強審校

缺血性腦卒中(cerebral ischemia,CI)是全球第二大死亡原因，也是導致殘疾的主要原因。隨著人口老齡化社會的到來，其發病率明顯上升，給家庭、社會帶來了巨大的精神、物質負擔[1]。CI是由動脈粥樣硬化、高血壓病、血脂異常、糖尿病等多種危險因素引起的[2]。缺血性腦卒中一旦發生可立即導致離子平衡破壞、代謝衰竭和腦細胞中一般蛋白質合成減少，繼而誘發梗死灶周圍去極化、興奮性毒性、氧化應激、炎癥反應和血腦屏障(blood brain barrier,BBB)破壞，可導致神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞、少突膠質細胞和內皮細胞等死亡[3]。近年來的研究發現，外泌體來源的microRNA(miRNA)與CI的發生發展具有密切的關系，腦組織中miRNA的表達、分布和作用，成為早期診斷的分子標志物和有效的治療靶標，且miRNA能自由通過BBB。miRNA可通過參與細胞凋亡、血管新生、氧化應激抑制、神經炎癥及BBB調節等影響CI的發生發展。故本文對外泌體來源miRNA在細胞凋亡、血管新生、氧化應激抑制、神經炎癥以及BBB調節方面對CI形成的影響進行綜述。

1 外泌體及miRNA的生物學特性

外泌體是一種由晚期內體或多泡體(multivesicular bodies,MVBs)與質膜融合后釋放到細胞外環境的小囊泡，系脂質雙層球形結構，大小在30～200 nm之間。外泌體內容物包括蛋白質、脂類物質、氨基酸、代謝物、mRNAs和miRNA等，均可反映來源細胞的生物學特點[4]。miRNA是由21～25核苷酸組成的單鏈非編碼小RNA，其主要通過介導靶基因轉錄本的降解或抑制其翻譯，即從轉錄后水平上抑制相關基因的表達，從而影響生命進程中包括發育、分化、增殖和鐵死亡等多種生理病理過程。miRNA廣泛分布于動植物基因組中，其表達具有高度保守性、時序性和組織特異性[5]。作為腦卒中治療的靶點，基于miRNA的策略提供了快速起效。

2 miRNA與細胞凋亡

細胞死亡分為細胞壞死和細胞凋亡，是不可逆的細胞功能的結束。細胞凋亡與CI的發生密切相關，當線粒體功能異常時，可增強促凋亡相關因子表達，繼而激活線粒體凋亡通路，是引起急性腦梗死后半暗帶區神經元死亡的主要原因[6]。如miR-16系屬于miR-15/miR-16簇，已被較好地證明是凋亡相關miRNA。miR-16可在嚴重肢體缺血和腦卒中患者血清中升高，CI患者的血清miR-15a和miR-16表達水平與對照組相比，可分別升高8.3倍和42倍[7,8]。根據結構和功能，B淋巴細胞瘤2(B cell lymphoma,BCL2)家族蛋白在細胞凋亡中的作用可分為抗凋亡蛋白(BCL-2、BCL-xL和MCL-1等)和促凋亡蛋白(BAK、BAX和BIM等)，通過調節線粒體介導的細胞凋亡參與腦缺血，其中抑制細胞凋亡的主要蛋白是BCL-2。

Yan等[9]實驗證明，對小鼠采用大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)造模，與對照組相比，通過上調miR-21的表達可顯著降低p53和Bax的mRNA表達和蛋白水平，增加Bcl-2的mRNA表達和蛋白水平，顯著改善缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷，表現為每張冠狀位腦片梗死面積或總腦梗死體積減少，從而保護大腦免受缺血性損傷。長期的動物實驗及臨床研究中發現，在數小時內，缺血半影區中的神經元短暫地經歷可逆性損傷，并最終發生細胞凋亡，在很大程度上導致I/R損傷中的細胞死亡。作為BCL-2的上游調節因子，磷酸化信號傳導與轉錄活化因子-3(phosphorylation signal transduction and transcription activator-3,p-STAT3)的表達與BCL-2的動態表達一致。在腦缺血再灌注損傷早期，實驗研究發現miR-124、信號傳導及轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)與p-STAT3的表達水平在12 h內達到峰值，miR-124的動態表達通過抗凋亡蛋白BCL-2和STAT3有效抑制細胞凋亡，表現出可保護神經元免受腦缺血而發生死亡的作用[10]。這些結果證實了miRNA與細胞凋亡關系緊密，可減輕腦缺血損傷，保護神經元。

3 miRNA與血管新生

血管生成已被證明是導致腦缺血后腦微脈管系統改變的重要事件。局灶性缺血發作后，在嚙齒動物和非人類靈長類動物模型中，缺血性核心區域的邊界似乎會刺激血管生成。在這些模型系統中，腦缺血發生后4～14 d內可在局部缺血區域觀察到新的毛細血管及軸突生長[11]。Zhang等[12]通過小鼠實驗證明，將C肽與外泌體結合，并負載膽固醇修飾的miR-210(RGD-exo：miR-210)，將RGD-exo：miR-210靜脈靶向注射到腦缺血區域，隔天給藥一次，連續給藥14 d，發現miR-210、整合素β3、血管內皮生長因子和CD34的表達顯著上調，促進腦缺血后腦組織修復的血管生成，小鼠存活率顯著提高。內皮細胞是新生腦微血管的主要成分，其功能是血管生成所必需的，包括形態發生、遷移、增殖等。Arderiu等[13]的實驗研究發現，脂肪間充質干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)促血管生成潛能的調節受miR-145的控制。在ADSCs中，內皮細胞分泌的堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)與其受體相互作用，誘導蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)，調節叉頭盒轉錄因子O1(forkhead box O1,FoxO1)轉錄活性，降低miR-145的表達。敲低miR-145可促進ADSCs分化為內皮細胞，內皮細胞標志物表達增加并誘導毛細血管的形成。另一項研究表明，慢病毒敲低原代小鼠或人腦微血管內皮細胞培養物中的miR-15a/16-1簇可增強氧糖剝奪后的體外血管生成，上調促血管生成蛋白表達。該研究還表明血管內皮靶向敲除miR-15a/16-1簇通過促進血管重塑和刺激功能性血管的生成，促進卒中后血管新生，增加同側腦血流[14]。而慢病毒過表達miR-15a/16-1簇可抑制體外血管生成，下調促血管生成蛋白表達。

4 miRNA與氧化應激抑制

氧化應激是指體內活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生與抗氧化防御之間的不平衡，導致ROS蓄積過多而引起機體細胞氧化損傷的過程。氧化應激是腦I/R損傷中最常見、研究最充分的因素，闡明腦I/R損傷氧化應激機制已成為治療缺血性腦卒中的重要問題[15]。

NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)是許多細胞類型中ROS的主要來源[16]。Zuo等[17]通過MCAO小鼠造模，測定小鼠腦組織或細胞的基因表達水平、ROS產生和凋亡情況，并進行生物信息學分析，NOX2在I/R模型的腦組織和缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型的人神經母細胞瘤細胞(Human neuroblastoma cells,SH-SY5Y)中顯著升高，而miR652在腦組織和血漿中的表達顯著降低。過表達miR652顯著抑制H/R作用下SHSY5Y細胞NOX2的表達和ROS的生成，并降低轉染報告基因質粒的細胞相對熒光素酶活性。錳超氧化物歧化酶(manganese-containing superoxide dismutase,MnSOD)和細胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase，EcSOD)具有抗氧化活性，對機體內ROS清除的平衡至關重要，而核因子E2相關因子2(nuclear factor erythtoid 2 related factor 2,Nrf2)是氧化還原敏感的轉錄因子，可激活超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)表達，從而保護細胞抵抗氧化應激損傷。miR-424表達水平升高降低I/R梗死體積，抑制神經元凋亡，降低皮質ROS和丙二醛水平，增加MnSOD和EcSOD的表達和活化以及氧化還原Nrf2的表達。在神經元培養中，miR-424表達水平升高還可消除H2O2誘導的損傷，表現為降低乳酸脫氫酶漏出和丙二醛水平，提高細胞活力和MnSOD活性；通過Nrf2敲除和SOD抑制劑處理逆轉miR-424對氧化應激的保護作用，表明miR-424具有通過抑制氧化應激來預防短暫性腦缺血/再灌注損傷的潛力[18]。

5 miRNA與神經炎癥

腦I/R損傷誘導的氧自由基的異常往往在激活氧化應激的同時，還破壞線粒體膜上的鈣離子泵并造成谷氨酸誘導的細胞內鈣離子的累積，從而導致神經細胞炎癥。神經炎癥是導致腦I/R損傷發展的主要病理生理因素。

大量研究表明，許多miRNA與CI后神經炎癥反應的調控有關。如有學者報道，miR-210在CI患者病灶周圍腦白質中的星形膠質細胞較對照神經組織腦白質中的星形膠質細胞表達增加1.6倍。miR-210過表達增加促進星形膠質細胞糖酵解活性，乳酸生成增強，抗炎分子表達增加，同時抑制促炎介質的表達[19]。Zhou等[20]通過蛋白免疫印跡試驗結果發現，miR-19a/b-3p抑制劑通過增加沉默信息調節因子1(sirtuin1,SIRT1)水平及降低調節叉頭盒轉錄因子O3(forkhead box O3,FoxO3)、鞘氨醇激酶1 (sphingosine kinases 1,SPHK1)和核轉錄因子-κβ(nuclear factor kappaB,NF-κβ) p65水平，逆轉氧糖剝奪/復氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)誘導的蛋白表達變化。同樣，miR-19a/b-3p抑制劑可抑制OGD/R損傷后腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β等炎性因子水平的升高，提示通過靶向miR-19a/b-3p/SIRT1/FoxO3/SPHK1抑制炎癥反應，可能是改善CI預后的一個有前景的途徑。

6 miRNA與BBB調節

中樞神經系統(central nervous system，CNS)的血管具有獨特的屏障性質。內皮細胞是構成CNS血管的細胞，通過強的緊密連接、特異性的轉運蛋白和有限的內吞作用，共同保護大腦免受毒素的侵害，維持大腦的穩態[21]。卒中后血腦屏障的破壞促進炎癥，使白細胞等免疫細胞能夠通過血腦屏障遷移并浸潤CNS實質。白細胞促進壞死組織的清除和神經元的恢復，但同時也加重BBB損傷，加重CI結局，尤其是再灌注后期[22,23]。

許多差異表達的miRNA已被報道在CI后BBB調節中發揮作用[24,25]。Wang等[26]的研究顯示，鋅轉運蛋白4(Zinc Transporter 4,ZnT4)是miR-30a負調控的直接靶點，下調miR-30a的表達水平，可以降低MCAO小鼠微血管中鋅的蓄積，增加ZnT4的表達，阻止緊密連接蛋白的丟失。即使在MCAO后90 min，也能阻止BBB損傷，減少腦梗死體積，改善神經功能缺損。E-選擇素(e-selectin,Es)是在炎癥過程最初階段出現的粘附分子，可引起血管細胞粘附分子1(vascular cellular adhesion molecule-1,VCAM-1)表達增加，參與損傷血管內皮細胞，從而加劇腦損傷。觀察組與對照組相比，在MCAO小鼠腦組織中miR-126-3p/-5p過表達使VCAM-1和Es表達分別下調3.3倍和3.4倍，顯著減少梗死灶，減輕水腫，保護BBB的完整性[27]。還有實驗研究發現，miR-98過表達可使MCAO小鼠的血腦屏障通透性降低兩倍，3 d后淋巴細胞抗原6復合物高表達(lymphocyte antigen 6 complexhigh,Ly6Chigh)單核細胞減少1.79倍，缺血腦組織內活化小膠質細胞減少兩倍，結果提示miR-98過表達可以保護BBB免受促炎Ly6Chigh單核細胞的穿越，從而阻止小膠質細胞的進一步激活[28]。

7 前景與展望

CI發生發展過程復雜，由于BBB的存在，只有少數小分子藥物能夠通過血流進入腦實質，大分子藥物則無法通過BBB，故研究miRNA對其調控機制為CI的防治提供新思路和新靶點具有重要意義。miRNA作為一種可同時調控多種通路及蛋白的非編碼RNA，可通過減輕細胞凋亡、抑制氧化應激及炎癥反應等方面，從而減輕腦缺血損傷的發生，維持BBB的完整性，促進血管新生，改善神經功能。目前，關于CI的發病機制及治療的研究較多集中在識別和鑒定與腦卒中相關的miRNA，明確其作用及機制。動物實驗研究的重點主要集中于應用miRNA相關抑制劑及模擬物注射小鼠等低級動物。由于患者難以接受側腦室注射miRNA的給藥途徑，故臨床研究缺乏。隨著我們進一步對CI發病機制中miRNA表達和功能的認識的提高，以及對動物實驗研究的樣本廣泛性的增加，進行綜合比對分析，后續必將為探索miRNA治療CI的創新性治療策略提供潛在的指導和幫助，具有十分廣闊的應用前景。