BNIP3L/NIX介導線粒體自噬對缺血性腦卒中作用的研究進展

張鳳娟綜述，楊 薇審校

腦卒中是一種中老年多發的，具有致殘率和死亡率的常見病[1]。腦卒中分為缺血性(ischemic stroke)和出血性(hemorrhagic stroke)兩種類型，缺血性腦卒中約占87%[2]。缺血性腦卒中的發生機制十分復雜，涉及興奮性氨基酸毒性、鈣離子超載、炎癥反應、細胞凋亡、線粒體功能障礙等，且這些因素相互影響相互聯系，形成惡性循環，最終造成不可逆性腦損傷[3]。研究發現，大腦產生的ATP大部分用于神經元生電活動[4]。因此，線粒體提供足夠的能量對神經元的興奮性和存活至關重要。除了產生能量外，線粒體和NADPH氧化酶，是活性氧(reactive oxygen species,ROS)的主要來源，并作為細胞凋亡調節劑[5]。越來越多的證據表明，在各種神經系統疾病中，ROS過量產生與神經元死亡之間存在密切關系，這與腦缺血的發病機制也密切相關[6]。因此，線粒體功能障礙是缺血性腦卒中發展的重要環節，線粒體功能障礙引起的線粒體自噬與缺血性腦卒中是密不可分的。

1 線粒體自噬與缺血性腦卒中

1.1 自噬的概念 自噬的原始科學定義(希臘語，“自食”)是將細胞質成分輸送到溶酶體進行降解，自噬貨物一般包括胞質蛋白、膜封閉的細胞器、細胞核的一部分，甚至溶酶體本身，從而實現組織細胞的需要或部分細胞器的更新[7]。至少有3種不同形式的自噬-分子伴侶介導的自噬、微自噬和巨自噬[8]。不同類型的自噬在維持組織和細胞內環境穩定中發揮著特定的作用。

1.2 線粒體自噬的概念和過程 線粒體自噬是指細胞通過自噬調控機制選擇性清除損傷或功能障礙線粒體的過程，可能在調節線粒體功能和維護細胞生存具有重要作用[9]。線粒體自噬首先起始于受損線粒體的識別，然后被雙膜自噬體吞噬，導致選擇性降解[10]。線粒體自噬可分為“兩步模型”：第一步，首先受損的線粒體被Parkin泛素化，泛素化的線粒體和自噬相關基因ATG上游調控蛋白與自噬小體結合位點發生耦聯，第一步不依賴于微管相關蛋白1輕鏈(LC3-PE) 或隔離膜形成;第二步，形成自噬小體。受損的線粒體被隔離膜逐漸包裹，形成具有雙層膜結構的自噬小體，自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，被包裹的線粒體在溶酶體酶的作用下被降解利用。該過程不僅需要LC3-PE及連接LC3與線粒體的接頭蛋白p62、optineurin、NBR1的參與同時BNIP3L/NIX在這一階段也發揮了關鍵作用。線粒體自噬作為自噬的重要形式之一，參與調控細胞內穩態、增殖、分化、遺傳、衰老和死亡等細胞進程，同時也通過控制線粒體質量增強線粒體對環境的應激性[9]。線粒體自噬對于細胞和組織的穩態至關重要，并參與細胞衰老的自然過程以及各種人類疾病，包括癌癥、固有免疫疾病、肌肉萎縮癥和神經退行性疾病，且其在缺血性腦卒中的發生發展過程中更是扮演著不可替代的角色[11]。

1.3 線粒體自噬及其在缺血性卒中中的作用 Lemasters等人于2005年首次提出線粒體自噬這一概念，其指細胞為維持正常生理過程進化產生的一種利用自噬活動選擇性清除損傷線粒體的機制，這一機制可能具有減少由衰老引起的線粒體DNA突變的作用[12]。缺血性卒中是局部腦血流量嚴重減少，導致嚴重缺氧和缺糖，而缺氧和缺糖引起的線粒體功能障礙在缺血后數分鐘內發生，導致ATP生成減少和活性氧化物(ROS)生成過多[13]。在缺血性卒中中，線粒體自噬可由BNIP3L/NIX通路介導。在腦缺血期間，缺氧會增強BNIP3L和NIX的表達，觸發beclin-1從Bcl-2/beclin-1復合體中釋放出來，并最終誘導線粒體自噬[14]。事實上，線粒體自噬激活在缺血性中風中的作用是有爭議的[15]。適度的線粒體自噬具有神經保護作用，而過度的線粒體自噬則有害[16]。適度的線粒體自噬清除缺血/再灌注損傷的線粒體可以改善線粒體功能，例如平衡ROS和ATP的生成以及抑制細胞凋亡，從而有助于保護腦缺血/再灌注損傷[17]。然而過度的線粒體自噬可能會加劇腦缺血損傷。ROS和活性氮(reactivenitrogenspecies,RNS)是激活線粒體自噬的關鍵參與者[18]。過氧亞硝酸鹽是一種RNS，可促進動力蛋白相關蛋白1(Drp1) 向受損線粒體募集，誘導過度線粒體自噬，從而加重腦缺血后的腦損傷[19]。柚皮苷是一種天然抗氧化劑，可以抑制過氧亞硝酸鹽介導的線粒體自噬以防止缺血/再灌注損傷[19]。因此，線粒體自噬在缺血性腦卒中的作用可能是一把雙刃劍。

2 BNIP3L/NIX與線粒體自噬

目前研究，線粒體自噬的途徑主要分為兩大類，一類是通過PINK1/Parkin介導的;一類是涉及線粒體自噬受體蛋白。目前已知的線粒體受體蛋白有：FUNDC1、Bcl2-L-13、Prohibitin2和BNIP3L/NIX[20]。這些受體定位在線粒體上，通過與LC3相互作用介導線粒體自噬。其中BNIP3L/NIX是一種定位在線粒體外膜上的Bcl-2家族蛋白。BNIP3L作為一種線粒體自噬受體，在細胞發育或病理條件下，可以通過與自噬泡相關蛋白LC3結合促進線粒體自噬[21]。BNIP3L轉錄在多種細胞缺氧條件下被誘導，暗示BNIP3L參與缺氧誘導的線粒體自噬[20]。然而BNIP3L作為一種線粒體自噬相關蛋白的貢獻似乎在腦缺血等病理條件下被低估了。因此，進一步鑒定BNIP3L誘導線粒體自噬的分子機制有望為開發腦缺血療法以調節線粒體自噬過程建立生物學原理。

2.1 BNIP3L的結構與作用 BNIP3L是一種由194個氨基酸組成的蛋白質，主要定位于線粒體外膜，少量定位于內質網膜及核膜[22]。正常生理條件下BNIP3L在心、肝、腎、腦、胰、肺、骨骼肌和胎盤等多種人類正常組織中均有表達，但表達量很低[22]。僅能從人骨骼肌細胞和腦細胞中檢測到BNIP3L的低水平表達。BNIP3L蛋白包含以下幾個功能結構域：(1)PEST結構域：該結構域位于54-81位氨基酸，富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，參與BNIP3L蛋白的降解；(2)BH3結構域：該結構域位于104-119位氨基酸，參與BNIP3L介導的caspase依賴性線粒體凋亡途徑；(3)氨基端結構域(NH2結構域)：該結構域與BH3結構域具有相似的功能；(4)跨膜結構域(TM結構域)和羧基端結構域：該結構域位于164-194位氨基酸，是BNIP3L行使其促凋亡功能最重要的結構域[11]。BNIP3L位于線粒體外膜上，可通過與Atg8家族蛋白直接結合將吞噬細胞(自噬體的前體)募集到線粒體[23]。BNIP3L可能在線粒體自噬誘導中與PARK2協調[23]。

2.2 NIX的結構與作用 NIX是從人胎盤cDNA文庫中克隆出來的蛋白質，其56%與BNIP3L同源性，位于線粒體外層，同BNIP3L一樣，NIX定位于線粒體，與Bcl-2和Bcl-xl相互作用，可誘導細胞凋亡[24]。另外，BNIP3L和NIX都包含相同的N端LC3相互作用域。在哺乳動物中，絲氨酸殘基17和24的磷酸化作用促進BNIP3L/NIX和LC3相互作用，加快線粒體自噬和降解。BNIP3L和NIX的啟動子序列中均含有低氧反應元件，受HIF-1調節。低氧條件下，BNIP3L/NIX結合Bcl-2后促使Beclin-1游離，通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途徑誘導Atg-5依賴的自噬發生[9]。因此，BNIP3L和BNIP3L/NIX介導的線粒體自噬可能與機體低氧適應密切相關。BNIP3L/NIX介導的線粒體自噬在許多疾病中發揮著重要的作用。

2.3 BNIP3L/NIX介導線粒體自噬對缺血性腦卒中的作用 BNIP3L/NIX位于線粒體外膜上，在細胞發育或病理條件下作為有絲分裂吞噬受體[21]。研究發現BNIP3L基因缺失顯著可阻斷缺血再灌注誘導的神經元線粒體自噬，從而加重缺血腦損傷[24]。大量研究發現，BNIP3L作為線粒體自噬治療卒中干預的潛在靶點[25]。然而，目前尚不清楚如何通過調節BNIP3L來調控缺血神經元的有絲分裂吞噬。BNIP3L在哺乳動物細胞中形成單體或同型二聚體，然而，BNIP3L的同型二聚體和單體對有絲分裂吞噬的作用尚未闡明[26]。因此，進一步研究缺血腦中BNIP3L的分子調控可能為腦缺血提供新的治療方法。

BNIP3L是介導線粒體自噬的受體相關因子之一。BNIP3L與LC3相互作用，通過其朝向細胞質的LC3相互作用區(LIR)基序將受損的線粒體連接到自噬體，啟動線粒體自噬過程[27]。在自然殺傷細胞中，BNIP3L和BNIP3L在清除功能失調的線粒體和線粒體相關的活性氧化物質(ROS)以促進細胞存活方面發揮重要作用[28]。BNIP3L基因敲除小鼠在短暫大腦中動脈閉塞后表現出線粒體自噬受損、梗死體積更大和神經功能缺損更嚴重[29]。最近在一項關于線粒體5對腫瘤壞死因子α誘導的小膠質細胞BV-2細胞凋亡影響的研究中記錄了通過藥物誘導的BNIP3L介導的線粒體自噬的上調來誘導細胞保護的可行性[30]。研究表明，BNIP3L基因敲除小鼠在短暫大腦中動脈閉塞后表現出線粒體自噬受損、梗死體積更大和神經功能缺損更嚴重[29]。Chen等[31]采用短暫大腦中動脈閉塞(tMCAO)建立缺血性腦卒中大鼠模型，在離體細胞水平，觀察了TAT-SPK2肽如何防止腦缺血再灌注，探討BNIP3L/NIX信號通路介導線粒體自噬在缺血性腦卒中的保護作用。結果發現，TAT-SPK2通過激活BNIP介導的線粒體自噬來保護神經元免受缺血/再灌注損傷。Yang等[29]采用大腦中動脈閉塞法建立缺血性腦卒中大鼠模型，觀察了缺血性腦卒中大鼠腦梗死體積及LC3、Beclin1、PINK1和Parkin的表達水平，探討了BNIP3L/NIX信號通路介導線粒體自噬對缺血性腦卒中大鼠的作用。研究發現，BNIP3L敲除( BNIP3L-/-)會損害小鼠的線粒體自噬和加重腦缺血再灌注損傷，這可以通過BNIP3L過表達來挽救，同時可以在Parkin敲除小鼠中觀察到BNIP3L過表達的拯救作用，其在腦缺血再灌注后表現出線粒體自噬缺陷。有趣的是，BNIP3L和PARK2雙基因敲除小鼠在腦缺血再灌注治療下表現出協同的線粒體自噬缺陷，這進一步突出了BNIP3L介導的線粒體自噬的作用，因為它獨立于PARK2。該研究結果進一步證實了BNIP3L/NIX信號通路通過介導線粒體自噬參與了缺血性腦卒中的病理生理過程，并且在其中發揮保護作用。

因此，BNIP3L/NIX信號通路介導的線粒體自噬在缺血性腦卒中的發生發展過程中發揮著不可替代的作用。如果能夠準確調控BNIP3L/NIX介導的線粒體自噬，很可能會找到防治缺血性腦卒中新的治療靶點和作用機制。

3 小結與展望

缺血性腦卒中是危害人類健康的常見病，尤其是老年人發病率和死亡率較高，如何有效降低缺血性腦卒中的發病率和死亡率已成為臨床急需解決的客觀難題。缺血性腦卒中發生后，可嚴重破壞線粒體的形態、結構和功能，引起細胞能量代謝障礙，甚至引發惡性級聯反應[3]。線粒體自噬在缺血性腦卒中發生后可以應激性被激活，神經元可以受損的線粒體并將它們轉移到星形膠質細胞進行處理和回收，在缺血性神經元損傷和恢復中具有重要作用[32]。BNIP3L/NIX是介導線粒體自噬的關鍵通路，在調節線粒體自噬和維持線粒體質量等發面發揮著重要作用[29]。BNIP3L基因缺失，可阻斷缺血再灌注誘導的神經元線粒體自噬，從而加重缺血腦損傷[29]。然而，但是隨著線粒體自噬和缺血性腦卒中進一步研究，線粒體自噬是一把“雙刃劍”，其在缺血性腦卒中的作用可能與腦缺血時間、缺血程度及再灌注不同病理過程密切相關，過度線粒體自噬可引起自噬性細胞損傷，加重缺血性腦卒中。因此，如何更加精準地調控BNIP3L/NIX介導的線粒體自噬，甚至應用某些藥物進行干預，充分發揮BNIP3L/NIX介導的線粒體自噬在缺血性腦卒中的神經保護作用，將是我們進一步努力研究的方向。