復方七芍降壓片對SHR大鼠內皮細胞線粒體自噬和炎癥應激的影響*

曹彥花， 雍蘇南， 李蘇**， 樂金海， 李俊， 王忠良， 劉梅， 劉慧

(1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院 心血管科， 湖南 長沙 410021； 2.長沙市中醫醫院 骨傷科， 湖南 長沙 410000； 3.長沙醫學院 基礎醫學院， 湖南 長沙 410219； 4.長沙醫學院 臨床醫學院， 湖南 長沙 410219； 5.長沙醫學院 公共衛生學院， 湖南 長沙 410219)

高血壓是全球廣泛流行的慢性疾病，全球患病率逐年增加大約10%，可顯著增加心血管病及靶器官損害風險[1]。目前將無法明確病因的高血壓稱為原發性高血壓(essential hypertension，SHR)，SHR患者血管內皮存在明顯的功能障礙，內皮細胞線粒體自噬障礙可能是啟動微血管床病理生理改變的主要內因，而衍生出β受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑等臨床西醫降壓藥[2]。長期使用西醫降壓藥，部分患者有明顯的頭暈或惡心癥狀，耐藥性也比較常見[2]。復方七芍降壓片是用于腎陰虛、瘀血阻絡型高血壓患者的常用藥物，能改善SHR而導致的動脈內膜粗糙、管壁增厚，緩解炎癥介質對血管內皮的損傷，可有效逆轉血管異常增生[3]。研究指出，哺乳動物體內的促炎、抗炎系統持續處于動態平衡中，其反應程度直接決定了血管損傷的修復效果，復方七芍降壓片發揮降壓效果的機制則可能與其減少炎癥介質釋放有關[4-5]，但其干預SHR的具體機制尚無定論，本研究探討其對內皮細胞線粒體自噬、炎癥應激損傷的影響，報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物和材料

1.1.1實驗動物 50只8周齡SPF級Wistar雄性SHR大鼠購自北京維通利華實驗動物公司[許可證書SCXK(湘)2019-214]，體質量210～250 g，分籠飼喂(每籠10只)，飼喂室溫(24.0±2.0)℃，相對濕度(60.0±5.0)%，晝夜交替(各12 h)，常規飼養7 d后開始實驗。

1.1.2主要儀器和試劑 AUW2200分析天平(日本島津)、BP98A無創血壓計(北京軟隆生物技術有限公司)、CKX53倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)、WH-866旋渦振蕩器(江蘇太倉華利達實驗室設備公司)、MK3多功能酶標儀(中國賽默飛世爾儀器有限公司)、DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥箱等，大鼠丙二醛(MDA)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒購自欣博盛公司，蘇木精(國藥滬試，批號71020782)、伊紅Y (國藥滬試，批號71014544)、組織線粒體分離試劑盒(上海碧云天生物公司)等。

1.1.3主要藥物 復方七芍降壓片(湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科，批號20190111)，厄貝沙坦(杭州賽諾菲制藥有限公司，批號5A159)等。

1.2 研究方法

1.2.1造模及干預 無菌條件下結扎大鼠雙腎動脈下極分支，采用高脂高鹽飼料喂養60 d，以制備高血壓模型，造模結束在大鼠安靜、清醒條件下測量尾動脈血壓，單日隨機重復檢測3次，取成功造模大鼠進行后續實驗[4]。采用隨機數字表，將大鼠均分為空白組[予10 mg/(kg·d)生理鹽水灌胃]、陽性對照組[予10 mg/(kg·d)厄貝沙坦灌胃]及復方七芍(低、中、高)劑量組[分別予5、10、20 mg/(kg·d)復方七芍降壓片灌胃]， 1次/d、連續30 d。

1.2.2組織處理 干預30 d時用乙醚麻醉大鼠，頸椎脫臼法處死，取20 mg腹主動脈組織置入EP管，用PBS洗凈殘留血液，冰上剪碎(1 mm×1 mm)，4 ℃ 3 000 r/min轉離心12 min，取上清液待檢。

1.2.3觀察指標 (1)內皮細胞線粒體功能相關蛋白：采用western blot法檢測，腹主動脈內皮細胞加入組織裂解液、磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑，勻漿靜置后再次離心30 min；變性聚丙烯酰氨凝膠電泳后，依次經過轉膜、封閉、抗體孵育、二抗孵育等步驟，用Bio-Rad凝膠成像系統采集PINK1、Parkin、LC3蛋白印跡信號[6-7]。(2)氧化損傷和炎癥損傷相關指標用黃嘌呤氧化酶酸法檢測MDA、SOD、CAT，用ELISA法檢測IL-1β、TNF-α、NO)[8-9]。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 腹主動脈內皮細胞PINK1、Parkin、LC3蛋白含量

干預后，陽性對照組、復方七芍各劑量組大鼠腹主動脈內皮細胞PINK1、Parkin、LC3蛋白高于空白組，復方七芍各劑量組低于陽性對照組，其中復方七芍低劑量組>中劑量組>高劑量組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 干預后各組大鼠腹主動脈內皮細胞線粒體功能相關蛋白含量比較Tab.1 Comparison of mitochondrial function-related protein contents in endothelial cells in SHR abdominal aorta tissues after treatment in each

2.2 腹主動脈組織內皮細胞SOD、CAT、IL-1β、TNF-α、NO含量

干預后，陽性對照組、復方七芍各劑量組大鼠腹主動脈組織內皮細胞MDA、IL-1β、TNF-α、NO含量高于空白組，復方七芍各劑量組低于陽性對照組，復方七芍低劑量組>中劑量組>高劑量組(P<0.05)。各組大鼠腹主動脈內皮細胞SOD、CAT含量比較，陽性對照組、復方七芍各劑量組大鼠低于空白組，復方七芍各劑量組高于陽性對照組，其中復方七芍低劑量組<中劑量組<高劑量組(P<0.05)。見表2。

2.3 氧化、炎癥指標與線粒體功能相關蛋白含量的相關性

對照組、陽性對照組、劑量組大鼠PINK1、Parkin、LC3蛋白含量與MDA、IL-1β、TNF-α、NO含量呈正相關，與SOD、CAT含量呈負相關。見表3。

表2 各組大鼠腹主動脈內皮細胞氧化損傷和炎癥損傷相關指標比較Tab.2 Comparison of related indexes of oxidative injury and inflammatory injury in endothelial cells in SHR abdominal aorta tissues in each

表3 SHR模型大鼠內皮細胞氧化、炎癥指標與線粒體功能相關蛋白含量的相關性Tab.3 Association of oxidative and inflammatory indexes with mitochondrial function-related proteins in SHR endothelial cells

2.4 氧化、炎癥指標含量對粒體功能相關蛋白含量的影響

分別以高劑量組線粒體功能相關蛋白含量為因變量，以內皮細胞氧化、炎癥指標含量為自變量，擬合回歸方程顯示，6項自變量(MDA、SOD、CAT、IL-1β、TNF-α、NO含量)對3項因變量(PINK1蛋白、Parkin蛋白、LC3蛋白)的綜合影響均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

3 討論

“病位在肝，根源在腎”是高血壓核心中醫病機，中醫防治高血壓講究“整體條理，辯證施治”原則。復方七芍降壓片因能改善SHR而導致的動脈內膜粗糙、管壁增厚，繼而有效緩解炎癥介質對血管內皮的損傷，最終有效逆轉血管異常增生現狀[10]。現有研究指出，哺乳動物體內的促炎、抗炎系統持續處于動態平衡中，其反應程度直接決定了血管損傷的修復效果，復方七芍降壓片發揮降壓效果的機制則可能與其減少炎癥介質釋放有關[11-12]。本研究旨在明確復方七芍降壓片對內皮細胞增殖、內皮細胞線粒體自噬狀況和炎癥應激損傷的具體影響，特對50只SHR大鼠進行了對照實驗研究。

表4 氧化、炎癥指標含量和粒體功能相關蛋白含量的回歸分析Tab.4 Regression analysis of the contents of oxidation, inflammation indexes, and mitochondrial function-related protein contents

研究數據顯示，復方七芍各劑量組大鼠腹主動脈組織內皮細胞PINK1、Parkin、LC3蛋白含量均低于陽性對照組，明降壓藥物干預SHR大鼠能直接改善內皮功能，而厄貝沙坦、復方七芍降壓片分別干預后后取得的短期效果亦有不同。結果還顯示，復方七芍高劑量組大鼠PINK1、Parkin、LC3蛋白的檢出水平均低于復方七芍低、中劑量組，說明在大鼠機體耐受的前提下，盡可能提高復方七芍降壓片使用劑量能保持線粒體穩態，降低功能障礙程度[13]。線粒體作為真核細胞融合、分裂的平衡細胞器，其自噬程度直接影響著多種疾病發生或發展過程。具體分析復方七芍降壓片作用機制，主要與其組方中不同藥物組合搭配充分激活了血管重塑進程有關[14-15]。三七、白芍為君主要發揮活血化瘀通絡功效；桑寄生、丹參、杜仲、天麻共為臣藥，則主要發揮補益肝腎功效；蘿芙木、葛根、地龍、炒香附共為佐藥，則發揮平肝清熱和息風通絡的功效[16]，可見復方七芍降壓片對SHR患者的調理作用不限定于心腦血管疾病，也有益于肝腎臟器的功能改善，但本研究尚未對SHR大鼠肝、腎指標進行檢測，也有待后續研究加以完善。

研究還顯示，復方七芍各劑量組大鼠腹主動脈組織內皮細胞MDA、IL-1β、TNF-α、NO含量均低于陽性對照組，同時復方七芍各劑量組大鼠腹主動脈組織內皮細胞SOD、CAT含量均高于陽性對照組，進一步說明氧化呼吸鏈中點子漏出情況有所減少，對應釋放至胞漿中的活性氧、凋亡因子可能也有所降低，最終將有助于降低線粒體損傷程度[17]。但是該研究尚未對腹主動脈組織進行病理形態觀測，不同復方七芍降壓片使用劑量將對腹主動脈管壁厚度、中膜厚度、管腔內徑造成何種長期影響，后續研究仍有待進一步探究。逐一分析各炎癥或應激指標在不同劑量組SHR大鼠腹主動脈內皮細胞中的表達差異，高劑量組大鼠多效細胞因子IL-1β的低水平表達，則有益于抑制纖維細胞增殖或膠原合成，有效緩解病情進展[18-19]。而多效能促炎癥因子TNF-α可直接引發血管內皮發生功能障礙，繼而導致血管平滑肌持續增生肥大，因此常用于模擬高血壓患者機體的炎癥微環境，該指標的低水平表達則能降低炎癥反應性疾病發生風險[20]。CAT含量差異則可能與復方七芍降壓片通過降低P2Y6表達，繼而抑制下游信號傳遞，并最終影響NFκB信號通路激活狀況有關[21]。但與SHR關聯的核內調控機制眾多，復方七芍降壓片抑制信號通路活動來發揮炎癥抑制、應激抑制效果的具體通路仍需進一步探究。MDA、SOD檢出含量在不同劑量復方七芍降壓片干預SHR大鼠的體內亦有顯著差別，可能與高水平復方七芍降壓片發揮抗氧化屏障功效，并直接激活抗氧化系統，恢復體內氧自由基代謝平衡有關，也可能與其限制線粒體氧化磷酸化過程，從而恢復線粒體能量代謝失調有關[22]。同時，MDA和SOD含量改變也會影響線粒體膜脂質的過氧化進程，繼而干擾神經毒性介質產生過程，最終影響炎癥級聯反應[23]。

相關性分析則發現，線粒體功能相關蛋白各項指標、氧化損傷和炎癥損傷各項指標均呈現出顯著關聯性，這種關聯效應不限于單一組別，對照組、陽性對照組、復方七芍各劑量組均有相同關聯方向，確診線粒體功能可直接或簡介參與內皮細胞氧化損傷、炎癥損傷過程。相關方向上，PINK1、Parkin、LC3蛋白與MDA、IL-1β、TNF-α、NO呈正相關，與SOD、CAT則呈負相關，該結果與上述討論分析基本一致。總的來說，復方七芍降壓片可有效維持細胞線粒體的自噬情況，保障細胞呼吸和能量轉化正常運行，在穩定線粒體功能的基礎上降低炎癥、應激反應，并最終保護內皮細胞功能[24-25]。回歸分析也發現，內皮細胞氧化、炎癥指標含量對高劑量組SHR模型大鼠線粒體功能相關蛋白含量均有顯著影響，擬合多項回歸方程均有統計學意義，進一步證實內皮細胞的氧化、炎癥過程會綜合影響疾病大鼠線粒體相關功能。因此，通過內皮細胞功能相關指標的含量檢測可一定程度上預測大鼠線粒體功能狀態，但其實踐效果仍需進一步擴大研究范圍，加以驗證。

綜上所述，復方七芍降壓片對內皮細胞的保護作用是通過多環節、多途徑、多靶點加以實現的，總的來說，安全范圍內加大復方七芍降壓片使用劑量，將有助于維持SHR大鼠炎癥、應激反應穩態。