基于RNA-Seq技術的真菌病毒AfPV1感染對寄主黃曲霉基因表達的影響*

江銀輝， 楊碧， 劉翔， 田詢， 禹文峰， 齊曉嵐， 吳昌學

(貴州醫科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室 & 貴州省醫學分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

真菌病毒是寄生在各種絲狀真菌和酵母中的病毒[1]。自從第1個真菌病毒在雙孢菇中發現以來，研究者在不同種類的真菌中都發現了真菌病毒[1-2]。目前已知真菌病毒的基因組大多數為雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)，也有單鏈RNA(single-stranded RNA，ssRNA)，少數為單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)[3]。通常情況下，真菌病毒不會影響宿主真菌的表型，但也有些病毒會對宿主表型產生了較大的影響[3-4]。在釀酒酵母中，研究人員發現感染輔助病毒L-A和殺手病毒的菌株可以分泌1種毒素，該毒素可以抑制其他未感染的酵母菌株[5]。感染真菌病毒Talaromycesmarneffeipartitivirus 1(TmPV1)的馬爾尼非青霉菌(Talaromycesmarneffei,T.marneffei)增強了對小鼠的致病力[6]；而真菌病毒誘導煙曲霉(Aspergillusfumigatus,A.fumigatus)減弱了對小鼠的致病力[7]。RNA測序(RNA-sequencing，RNA-seq)已被廣泛用于揭示生命現象的分子機理，也被用于研究病毒感染對宿主影響的分子機理[3, 8]。對真菌病毒而言，比較轉錄組分析能夠顯示病毒感染和病毒脫毒菌株之間的基因表達差異，比如感染A.fumigatus的病毒Apergillus chrysovirus 41362(AfuCV41362)、感染葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea,B.dothidea)的病毒B.dothideachrysovirus 1和病毒B.dothideapartitivirus 1、感染板栗疫病菌的病毒Cryphonectriahypovirus1(CHV1)、感染小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum,F.graminearum)的病毒F.graminearumhypovirus及病毒F.graminearumvirus 1等[9]。這些研究表明，真菌病毒的感染可以影響宿主真菌的許多重要生物學過程，包括代謝、轉錄調控、信號轉導、物質運輸、毒力因子表達和核糖體功能[10]。黃曲霉(Aspergillusflavus,A.flavus)是一種條件致病菌，在免疫功能缺陷的人群中引發曲霉感染[11]；此外，A.flavus還會產生具有強烈致癌的次級代謝產物A.flavus素[12]。近年來，發現A.flavus容易對現有抗菌藥物產生耐藥性[13]。因此，迫切需要新的治療策略控制A.flavus的感染。隨著越來越多的真菌病毒被發現能夠選擇性感染致病真菌，真菌病毒作為生物治療，已顯示出的巨大潛力[14]。本課題組前期研究分離得到一株能夠引起A.flavus表型嚴重衰退、孢子產量減少和生長速度減慢的真菌病毒A.flavuspartitivirus1(AfPV1)[15]。真菌病毒AfPV1為雙分病毒科家族成員，病毒顆粒直徑約為40 nm，AfPV1基因組為3條dsRNA片段(dsRNA 1長度為1.7 kbp，dsRNA 2長度為1.4 kbp，dsRNA 3長度為1.1 kbp)[15]。為了闡明AfPV1感染引起寄主A.flavus表型改變的分子機理，本研究利用RNA-Seq技術分析真菌病毒AfPV1對寄主A.flavus基因表達的影響，并從轉錄組分析AfPV1與寄主A.flavus互作的分子機理。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1菌株及培養基A.flavus菌株LD-F1(不攜帶任何病毒并標記嘧啶磺胺抗性)、LD-F1-b(病毒AfPV1感染菌株LDF1獲得)，AfPV1(NCBI GenBank No. MK344768，No. MK344769，No. MK344770)，以上A.flavus菌株和AfPV1病毒由本課題組前期獲得。所有A.flavus菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA，土豆200 g、葡萄糖20 g及瓊脂粉12～15 g，蒸餾水定容至1 000 mL)，121 ℃滅菌20 min，平板30 ℃培養，4 ℃保存于PDA平板上。

1.1.2主要試劑和儀器 TRIZOL(美國invitrogen)，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑(大連寶生物)；超凈臺(蘇州金凈凈化)，生化培養箱(天津賽得利斯)，冷凍高速離心機(美國GENE)，PCR擴增儀(美國Applied Biosystem)，Agilent 2100(美國agilent)，分光光度計和Qubit 2.0(美國thermo)。

1.2 實驗方法

1.2.1A.flavus菌株RNA提取與質量檢測A.flavus菌株LD-F1和LD-F1-b分別接種于鋪有滅菌玻璃紙的PDA培養基上，30 ℃培養5 d；收集每個菌株的菌絲；使用TRIzol試劑提取A.flavus菌株的總RNA；稱取菌絲0.5 g，置于提前用0.1%焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)溶液處理過的研缽中，加液氮研磨成粉末。將研缽中的粉末用藥勺轉移至無RNA酶的離心管中，加TRIzol試劑1 mL和氯仿0.2 mL，劇烈震蕩混合，置于冰上靜置5 min，12 000 r/min于4 ℃離心10 min，取上清，轉入新的無RNA酶的離心管，加等體積異丙醇，上下顛倒混勻，于-20 ℃條件靜置2 h以上，12 000 r/min于4 ℃離心15 min，棄上清，加75%乙醇1 mL洗滌沉淀，12 000 r/min于4 ℃離心15 min，棄上清，得到RNA沉淀；RNA沉淀于室溫條件下干燥，加無RNA酶污染的去離子水20 μL溶解，-80 ℃保存；取RNA樣品2 μL，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶類型，Agilent 2100檢測RNA樣品的完整性；用Qubit和NanoDrop-2000分光光度計對RNA進行濃度和純度檢測。

1.2.2文庫構建和RNA-SeqA.flavus菌株RNA樣本由Novogene公司通過Illumina HiSeq 2000進行高通量測序，每個樣品3個重復；樣品RNA檢測合格，mRNA純化，打斷成小片段，用隨機引物進行反轉錄合成第1鏈互補DNA(complementary DNA，cDNA)，合成第2鏈cDNA鏈，純化雙鏈cDNA，PCR富集得到最終的cDNA文庫；使用Qubit 2.0對構建好的cDNA文庫進行初步定量，用Agilent 2100對待測文庫中的插入片段長度進行準確測定，最后使用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)方法對cDNA文庫的有效濃度進行準確定量(有效濃度>2 nmol/L)；cDNA文庫檢測合格后，將不同文庫按照濃度要求和測序數據量要求進行測序。

1.2.3序列分析 (1)通過去除低質量堿基和污染序列，將原始測序數據進行過濾，然后以美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/360?genome_assembly_id=968150)的A.flavus菌株NRRL 3357的參考基因組；(2)基于P<0.05，通過比較Reads Per Kilobase Per Million mapped Reads(RPKM)的差異獲得A.flavus差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)；(3)對A.flavus的DEGs進行基因本體(gene ontology，GO)注釋和京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)進行功能富集分析。

1.2.4qRT-PCR分析 隨機挑選A.flavus12個基因，采用qRT-PCR方法進行相對表達量驗證。qRT-PCR在實時熒光定量PCR檢測系統中，使用TB Green?Premix Ex TaqTM進行；PCR反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸20 s，共40個反應循環；在每個PCR反應結束時分析每個基因的熔體曲線，A.flavus肌動蛋白基因(7910404)作為內參基因。檢測基因相對表達量的引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.3 統計學分析

差異基因統計使用DESeq軟件進行標準化，然后進行負二項分布分析，使用Benjamini和Hochberg的方法對P值進行調整，調整后log2(foldchange)的絕對值大于1(P<0.05)，則認為基因表達具有差異；GO富集分析采用的軟件Goseq，基于Wallenius非中心超幾何分布模型通過對基因長度的偏好性進行估計，計算出GO條目中差異基因富集的概率；KEGG顯著性富集分析以KEGG數據庫中基因信號通路為單位，應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比較存在差異表達基因中顯著性富集的通路，富集因子越大，表示富集的程度越大；q值是做過多重假設檢驗校正之后的P值，范圍為0～1，越接近于零，表示富集越顯著；qRT-PCR數據采用軟件GraphPad Prism 7.0進行統計學分析，以均數表示。

2 結果

2.1 RNA質量

樣品菌株LD-F1和LD-F1-b的總RNA條帶清晰，無污染(圖1)；RNA完整性(RNA integrity number，RIN；RIN值介于6～8)好，總RNA純度良好(OD260/OD280介于1.8～2.0)，樣品質量滿足測序建庫要求(表2)。

注：M為DNA marker，1為菌株LD-F1的RNA，2為菌株LD-F1-b的RNA圖1 樣品RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RNA samples

表2 樣品RNA質量Tab.2 Quality of RNA samples

2.2 測序數據質量

樣品測序結果可靠，錯誤率僅為0.02%，每組樣品的clean read的數據大于4 Gb，Q20>96%，Q30>90%(表3)；測序的結果能夠成功比對到A.flavus的基因組序列(>56%)，多匹配位點<2%，唯一匹配位點>56%，測序結果符合后續序列分析(表4)。

表3 測序數據質量Tab.3 Quality of sequencing data

表4 Reads與參考基因組比對情況Tab.4 Comparison between reads and reference genome

2.3 DEGs分析

與A.flavus菌株LD-F1相比，菌株LD-F1-b有4 127個 DEGs，其中被上調表達的基因為1 864個，被下調表達的基因為2 263個(圖2)；DEGs的GO注釋結果顯示了30個最顯著的GO，其中包括氧化還原過程、單生物過程、單生物代謝過程、跨膜轉運、谷氨酰胺家族氨基酸代謝過程、谷氨酰胺家族氨基酸生物合成過程、二羥酸代謝過程、單生物轉運、谷氨酸代謝過程、單生物定位、生物過程、谷氨酸生物合成過程、二羥酸生物合成過程、色氨酸代謝過程、Indolalkylamine代謝過程、含吲哚化合物的代謝過程、氨基酸代謝過程等18個生物過程，1個細胞組分(細胞投射部分)，氧化還原酶活性、催化活性、作用于配對供體的氧化還原酶活性、血紅素結合、谷氨酸合酶活性(glutamate synthase activity)、單氧酶活性、四吡咯結合、輔酶結合、FAD結合、輔因子結合、作用于L-氨基酸多肽酶活性、鐵離子結合等12個分子功能(圖3)。KEGG富集分析結果顯示，DEGs參與的KEGG代謝通路中最顯著的有20條，分別為酪氨酸代謝、色氨酸代謝、淀粉和糖代謝、丙酮代謝、苯丙氨酸代謝、戊糖與葡萄糖醛酸互相轉換、核苷酸切除修復、非同源重組末端連接、氮代謝、錯配修復、吲哚二萜生物堿的生物合成、同源重組、乙醛酸和二羧酸代謝、半乳糖代謝、葉酸生物合成、脂肪酸降解、DNA復制、生物素代謝、次級代謝產物的生物合成及堿基切除修復(圖4)。

注：紅色表示上調表達的基因，綠色表示下調表達的基因，藍色表示變化不顯著的基因。圖2 DEGs火山圖Fig.2 Volcano plot of DEGs

2.4 DEGs表達

從DEGs中隨機挑選12個基因，其中7個上調表達的基因，5個下調表達的基因；qRT-PCR的驗證結果顯示，與轉錄組測序結果變化趨勢一致(圖5)，表明轉錄組數據真實可靠。

3 討論

隨著大量使用廣譜抗生素，對腫瘤患者進行放療化療，以及對器官和干細胞移植的患者免疫抑制劑的使用，免疫力低下人群逐漸增多，導致曲霉病的發生率逐年升高[16]。A.flavus不僅是感染人和動物的條件致病菌，而且是很多植物的致病菌[16]。同時A.flavus能夠產生具有強烈致癌作用的A.flavus素B等次級代謝產物，嚴重威脅人類健康[17]。目前只有抗真菌藥物用于治療A.flavus感染，但容易引起耐藥菌株產生[18]。真菌病毒是一種選擇性感染真菌的病毒，有些真菌病毒能夠引起寄主致病力衰退，因此具有治療病原真菌感染的潛力[15]。目前真菌病毒已經應用于一些植物病原真菌的防治[19]，但未見應用于治療動物和人的真菌感染。本研究中，真菌病毒AfPV1的感染能夠引起寄主真菌A.flavus表型嚴重的衰退，具有治療A.flavus的潛力[15]。本研究對真菌病毒AfPV1調控A.flavus的差異基因進行分析，為獲得抗A.flavus潛在靶點提供參考。

雖然真菌病毒在真菌中廣泛存在，但其與宿主之間的相互作用機制尚不清楚。通過研究板栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica,C.parasitica)的真菌病毒，研究者發現RNA沉默是寄生C.parasitica抗病毒防御的機制之一[20]。C.parasitica的RNA沉默途徑的基因突變以后，增加了C.parasitica對真菌病毒感染的易感性，同時病毒蛋白p29被認為是真菌中RNA沉默介導的病毒防御的抑制因子[21]。RNA-seq能夠提供真菌病毒與寄主真菌相互作用機制的全面信息[3, 8]。通過比較相同基因型背景下，含有真菌病毒和不含真菌病毒的菌株轉錄組的差異，可以揭示由于真菌病毒感染引起寄主真菌癥狀的機制[8-9]。但是關于真菌病毒感染引起寄主真菌轉錄或轉錄后翻譯變化的研究并不多，其中包括A.fumigatus、板栗疫病菌C.parasitica、褐座堅殼菌Rosellinianecatrix、核盤菌Sclerotiniasclerotiorum和禾谷鐮刀菌Fusariumgraminearum[22-24]。盡管如此，大多數情況下真菌病毒調控的基因表達途徑的確切性質仍不清楚[25]。本研究通過比較含有真菌病毒AfPV1和不含AfPV1的菌株的轉錄組，得到4 127個DEGs。對這些DEGs進行GO注釋和KEGG富集分析，結果表明DEGs涉及A.flavus的氧化還原過程、單生物過程、單生物代謝過程、跨膜轉運、谷氨酰胺家族氨基酸代謝過程、谷氨酰胺家族氨基酸生物合成過程、二羥酸代謝過程及血紅素結合等；這些DEGs參與A.flavus代謝通路中的戊糖、葡萄糖醛酸轉換、非同源重組末端連接、氮代謝、錯配修復、同源重組、DNA復制、次級代謝產物的生物合成及堿基切除修復等。這些基因代謝途徑可能參與真菌病毒與寄主真菌互作的分子機理，但需要做進一步的基因功能驗證。

注：(1)P<0.05。圖3 DEGs的GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of DEGs

注：顏色變化表示q值由0到1，越接近于零，表示富集越顯著。圖4 DEGs的KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of DEGs

圖5 DEGs的qRT-PCR驗證Fig.5 Expression levels of DEGs confirmed by qRT-PCR