內質網應激抑制劑4-PBA對高糖誘導大鼠視網膜Müller細胞膠質增生的作用及機制*

酆嘯， 龍秋雙， 甘詩泉， 沈祥春*， 陳妍*

(貴州醫科大學 藥學院 & 貴州省高等學校天然藥物藥理與成藥性評價重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)是一類嚴重的糖尿病微血管病變[1]。體內長期高糖(high glucose,HG)環境下誘導的視網膜膠質增生，是DR的早期特征，其中Müller細胞作為視網膜中的主要支撐和營養細胞，在膠質增生中扮演重要角色[2-4]。研究表明，HG誘導Müller細胞發生膠質增生，表現為細胞異常增殖和膠質纖維酸性蛋白GFAP表達上調[5]，并且導致氧化應激、炎癥介質產生和分泌、以及視網膜內環境破壞[6-7]。尋找調節Müller細胞膠質增生的新機制，并以此為基礎進行創新藥物的開發，成為DR防治的研究熱點。內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是細胞內質網穩態失衡引發的一種病理過程，表現為內質網腔內錯誤折疊與未折疊蛋白聚集[8]。細胞內環境的改變可中斷蛋白質加工，導致內質網中未折疊蛋白質的積累，并激活未折疊蛋白質反應(unfolded protein response,UPR)，這種應激反應的觸發因素包括缺血、缺氧、HG和氧化應激等[9-10]。UPR最初旨在恢復內質網功能和促進細胞存活，但當持續發生ERS時，通過蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase RNA-like ER kinase ,PERK)途徑參與DR的發生，干擾視網膜細胞的生理代謝[11]。研究表明ERS與DR的病理過程密切相關，參與調節了DR中的氧化應激、炎癥、細胞凋亡、血-視網膜屏障破壞和血管生成等[12-13]。HG同樣可誘導Müller細胞發生ERS，此時葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)蛋白水平迅速上調，從內質網膜進入內腔，并通過作用轉錄激活因子4(activating transcription factor 4,ATF4)誘導血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白合成與分泌[14-15]，然而ERS與Müller細胞膠質增生的關系尚不清楚。因此，本研究通過建立HG誘導的Müller細胞膠質增生體外模型，使用ERS特異性抑制劑4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid，4-PBA)進行干預，探討ERS與Müller細胞膠質增生的關系，為抑制ERS防治DR的創新藥物提供實驗證據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株 視網膜神經膠質Müller細胞株購自上海冠導生物工程有限公司。

1.1.2主要藥物及試劑 低糖培養基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM；美國Gibco公司)和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS；美國Gibco公司)，4-PBA(美國MedChemExpress)，抗GRP78、PERK、eukaryotic translation initiation factor 2 alpha(eIF2α)、ATF4和glial fibrillary acidic protein(GFAP)單克隆一抗(武漢Proteintech)，抗磷酸化-eIF2α(p-eIF2α)、磷酸化-PERK(p-PERK，江蘇Affinity公司)，抗VEGF-A(美國Abcam公司)，單克隆一抗羊抗兔和羊抗鼠抗體(美國Bioword公司)。

1.1.3主要儀器 DMIL型倒置顯微鏡(德國LEICA公司)，NovoCyte流式細胞儀(艾森生物)，3020-426多功能全波長酶標儀(美國Thermo公司)，超凈工作臺SW-CJ-1型(中國蘇州凈化設備有限公司)，Heal force型細胞培養箱(中國上海力申科學儀器有限公司)，Microfuge20R型冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養及分組處理 Müller細胞置于含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM低糖培養基中37 ℃的5% CO2飽和濕度培養箱中培養，隔天換液至長滿。實驗分為Control組(5.5 mmol/L葡萄糖)、Mannitol組(34.5 mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L/L葡萄糖)、HG組(40 mmol/L葡萄糖)、4-PBA-L組(1 mmol/L4-PBA+40 mmol/L葡萄糖)及4-PBA-H組(5 mmol/L 4-PBA+40 mmol/L葡萄糖)，4-PBA給藥組及Mannitol組給予相應藥物預處理1 h，再加40 mmol/L葡萄糖繼續培養48 h。

1.2.2Giemsa染色 取對數增長期Müller細胞按1.2.1項下分組接種于24孔板中，待給藥預保護1 h，40 mmol/L 葡萄糖繼續培養培養48 h，棄原培養液，每孔加PBS洗3次，加4%多聚甲醛靜置固定細胞15 min；每孔加PBS搖洗3次；Giemsa染色液(濃縮液 ∶PBS=1 ∶5)沿壁加入，靜置染色5 min，PBS沖洗干凈，倒置顯微鏡下采集照片(100×)。

1.2.3二苯基四氮唑溴[3-(4,5-dimethyl-2- thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT]法檢測4-PBA對HG誘導Müller細胞增殖的影響 取對數生長期Müller細胞以密度為5 ×106個/L，接種于96孔板中，給予0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、7.5、10mmol/L 的4-PBA預處理細胞1 h，然后繼續培養48 h，采用 MTT法檢測Müller細胞存活率；同樣取對數生長期Müller細胞，以密度為5 ×106個/L，接種于96孔板中，按1.2.1項下分組培養2 d， MTT法檢測5組細胞的增殖，計算細胞存活率(細胞存活率= OD給藥組/OD對照組×100%)。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞周期 取“1.2.1”項下密度為1×109個/L的各組細胞，制成單細胞懸液1 mL，1 500 r/min離心5 min，棄上清，70%乙醇500 μL預冷，于4 ℃固定過夜；加RNA Nase(終濃度50 mg/L)100 μL于37 ℃水浴30 min；避光加碘化丙啶(propidium，PI；終濃度50 mg/L)400 μL ，室溫避光染色30 min；上機檢測，激發波長為488 nm，收集細胞10 000個以上。

1.2.5Western blot檢測相關蛋白的表達 取對數增長期的Müller細胞按“1.2.1”項下分組接種于培養皿中，待給藥預保護1 h，40 mmol/L 葡萄糖繼續培養48 h，棄原培養基，預冷PBS洗2次，加含1%蛋白酶抑制劑苯甲磺酰氟(phenylmethyl sulfonyl fluoride,PMSF)細胞裂解液(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解細胞、提取各組細胞總蛋白，采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BSA)蛋白定量；將蛋白樣品進行凝膠電泳分離，電泳時間1.5 h，濕轉法轉膜1.5 h，5%BSA溶液封閉1 h；加配制好相應濃度的一抗GRP78(1 ∶1 000)、ATF4(1 ∶1 000)、GFAP(1 ∶1 000)、PERK(1 ∶1 000)、p-PERK(1 ∶500)、eIf2α(1 ∶1 000)、p-eIf2α(1 ∶500)、VEGF-A(1 ∶1 000)及β-actin(1 ∶10 000)于4 ℃孵育過夜，洗膜3次，加入兔二抗(1 ∶10 000)室溫孵育1.5 h；采用Bio-Rad顯影成像系統獲取圖像，Image J分析軟件統計各蛋白印跡灰度值進行分析比較。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞形態

Giemsa 染色結果顯示(圖1)，Control組Müller細胞間隙明顯，分散均勻；HG組Müller細胞數目急劇增多，形狀變為圓，細胞間隙變小；1 mmol/L和5 mmol/L 4-PBA干預后，4-PBA-L組和4-PBA-H組Müller的細胞數量和形態有所恢復。表明4-PBA可減少HG誘導Müller數目和病理形態改變。

圖1 各組視網膜Müller細胞的形態學特征(Giemsa染色，×100)Fig.1 Morphological characteristics of retinal Müller cells in each group (Giemsa staining，×100)

2.2 細胞增殖活性及4-PBA濃度的確定

經0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、7.5及10 mmol/L 4-PBA進行給藥處理1 h，MTT法檢測結果顯示(圖2)，與Control組相比，Müller細胞在0～5 mmol/L 4-PBA干預下細胞存活率無明顯影響(P>0.05)；當4-PBA 濃度>5 mmol/L后，Müller細胞存活率下降(P<0.05)。此外，與Control組相比，HG組Müller細胞存活率升高(P<0.05)；給予1mmol/L和5 mmol/L 4-PBA預保護 1 h，與HG組相比，4-PBA-L組和4-PBA-H組 Müller細胞存活率下降(P<0.05)，Mannitol組無明顯差異(P>0.05)。

注：A、B為不同培養條件下Müller細胞增殖活性統計結果；(1)與同濃度24 h組比較，P<0.05；(2)與Control組比較，P<0.05；(3)與HG組比較，P<0.05。圖2 各組視網膜Müller細胞的增殖活性(MTT)Fig.2 Proliferative activity of the retinal Müller cells in each group(MTT)

2.3 細胞周期

流式細胞術檢測結果顯示(圖3)，與Control組相比，HG作用Müller細胞 48 h后，HG組Müller細胞S期所占比例增加(P<0.05)；而給予不同濃度4-PBA預處理1 h后，與HG組相比，4-PBA-L組和4-PBA-H組 Müller細胞S期所占比例減少(P<0.05)，Mannitol組無明顯差異(P>0.05)。

2.4 ERS相關蛋白的表達

結果如圖4所示，與Control組比較，HG作用Müller細胞 48 h后HG組Müller細胞ERS未折疊蛋白反應蛋白GRP78、p-PERK、p-eIf2α和ATF4 蛋白表達升高(P<0.05)；而給予不同濃度4-PBA(1 mmol/L、5 mmol/L)預處理1 h，與HG組相比，4-PBA-L組和4-PBA-H組 Müller細胞GRP78、p-PERK、p-eIf2α和ATF4 蛋白表達減少(P<0.05)，Mannitol組無明顯差異(P>0.05)。

注：A為流式細胞術檢測結果，B為流式細胞術檢測的定量結果；(1)與Control組比較，P<0.05；(2)與HG組比較，P<0.05。圖3 各組視網膜Müller細胞的細胞周期變化(流式細胞術)Fig.3 Cell cycle changes in retina Müller cells in each group(flow cytometry)

注：A、B分別為Western blot電泳圖和蛋白定量結果；(1)與Control組比較，P<0.05；(2)與HG組比較，P<0.05。圖4 各組視網膜Müller細胞GRP78、p-PERK、p-eIf2α及ATF4 蛋白的表達Fig.4 Levels of GRP78, p-PERK, p-eIf2α, and ATF4 protein expression in retinal Müller cells in each group

2.5 細胞膠質增生

Western blot結果表示(圖4)，與Control組比較，HG作用48 h后，HG組Müller細胞中GFAP和VEGF-A蛋白表達升高(P<0.05)；給予不同濃度4-PBA預處理1 h，與HG組相比，4-PBA-L組和4-PBA-H組 中Müller細胞GFAP、VEGF-A蛋白表達減少(P<0.05)，Mannitol組無明顯差異(P>0.05)。

注：A、B為VEGF-A和GFAP的Western blot電泳結果和蛋白定量統計結果；(1)與Control組相比，P<0.05；(2)與HG組相比，P<0.05。圖5 各組視網膜Müller細胞的GFAP和VEGF-A蛋白表達Fig.5 Levels of GFAP and VEGF-A protein expression in retinal Müller cells in each group

3 討論

DR是糖尿病常見的并發癥之一，也是糖尿病人視力下降的主要原因[16]。有研究認為，當糖尿病患者視網膜出現損傷時，早于血管病變和其他膠質細胞受損，視網膜Müller 細胞就已經發生形態和功能性病變[8]。Müller細胞是視網膜中維持視網膜內穩態的主要膠質細胞，能夠表達生長因子以滋養視網膜神經元和毛細血管細胞[17]。糖尿病長期存在的高血糖可誘導視網膜Müller細胞增殖活化，這是Müller細胞膠質增生的一種形式，也是導致DR發生的主要原因[18-19]。鑒于Müller細胞在維持視網膜神經血管結構和功能方面的重要性，糖尿病患者Müller細胞的功能障礙及隨之發生的膠質增生被認為是導致視網膜病變的主要因素[20-21]。因此，抑制或逆轉膠質增生過程可能是防治DR的重要策略。本研究結果表明，4-PBA能抑制HG誘導Müller細胞的異常增殖，并且可有效地改善HG誘導Müller細胞形態的異常改變。

內質網是負責蛋白質合成和加工的主要細胞器，其蛋白質折疊可受各種生理和病理條件干擾，導致ERS的發生[22]。ERS的3個跨膜傳感器PERK、IRE1和ATF6負責激活介導UPR和后續反應的下游信號通路[22-24]。據報道，UPR反應經典通路PERK-eIF2α-ATF4信號通路與DR密切相關[25]。越來越多的證據表明，ERS通過增加Müller的膠質增生促進DR的進展[26-27]；ERS抑制劑則可以改善視網膜神經病變[28]。GRP78是一種ERS蛋白，參與蛋白質的折疊和運輸，其表達與ERS呈正相關[29]。本研究結果顯示，與Control組相比，HG組內質網應激標志蛋白GRP78水平上調，表明Müller細胞在40 mmol/L葡萄糖誘導48h后發生ERS。此外，與Control組相比，HG組p-PERK、p-eIF2α、ATF4蛋白表達增加，表明HG組Müller細胞PERK-eIF2α-ATF4通路被激活，可能是糖尿病視網膜膠質增生發病機制中的主要信號通路。

研究表明，GFAP和VEGF-A的表達異常上調是DR中Müller膠質增生的顯著標志[30-31]；在HG處理的視網膜細胞中，緩解ERS或者抑制 ATF4 活性將減少細胞中VEGFA 及GFAP的表達，改善視網膜病變[31-32]。因此，本研究通過蛋白免疫印跡實驗探討4-PBA對HG誘導的Müller細胞中GFAP和VEGF-A表達的影響，結果表明，與HG組相比，4-PBA預處理1h后可顯著抑制HG誘導的Müller細胞中GFAP和VEGF-A蛋白表達增加。這些結果進一步表明了4-PBA可以通過下調HG誘導Müller中GFAP和VEGF-A的表達來抑制視網膜Müller細胞的膠質增生。

綜上所述，4-PBA可抑制HG誘導的視網膜Müller細胞膠質增生過程，恢復Müller細胞形態與功能，其作用與抑制ERSPERK-eIF2α-ATF4通路有關，但是4-PBA在體內的藥效作用仍待進一步的驗證。本研究為4-PBA藥物開發利用提供了理論基礎，也為臨床治療DR提供了新思路。