基于LC-MS/MS分析‘塔羅科’血橙優系果實花青素組分特征

楊 蕾，侯慧芳，王 敏，洪 林，楊海健，王 武，程 楊，譚 平

（重慶市農業科學院果樹研究所，重慶 401329）

血橙（Citrus sinensis(L.) Osbeck），蕓香科柑橘屬植物，是柑橘中唯一含花青素的品種[1]?；ㄇ嗨貫樘烊坏乃苄陨?，屬類黃酮物質，大多以花青素苷的形式存在，和糖結合形成花色苷[2-4]?；ㄇ嗨刂饕? 大類：矢車菊素、飛燕草素、芍藥花素、天竺葵素、錦葵素、矮牽牛素[5-6]。矢車菊素及芍藥花素呈紫紅色，天竺葵素表現為紅橙色，飛燕草素、錦葵素及矮牽牛素表現為藍紫色[7-8]?；ㄇ嗨乜寡趸芰O強，具有抗癌、抗炎、降低心血管病、治療糖尿病和降低其他慢性疾病風險等多種藥理作用[9-12]。

國內外學者對血橙花青素多年前就已有研究，血橙中花青素組分和含量因品種而異，還受到環境因素等多種條件的影響。經前人研究，血橙花青素主要成分為矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷等[13-14]。Dugo等[15]利用微量高效液相色譜-電噴霧離子化串聯質譜聯用技術首次鑒定出‘摩洛’、‘塔羅科’和‘桑吉耐洛’血橙中含芍藥花素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、飛燕草素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、芍藥花素、矮牽牛素5種少量成分。Hillebrand等[16]研究商業化血橙果汁花青素組成為2種主要成分：矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-(6-丙二酰葡萄糖苷)，6種次要成分：矢車菊素-3,5-O-二葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-槐糖苷、飛燕草素-3-O-(6-丙二酰葡萄糖苷)、芍藥花素-3-O-(6-丙二酰葡萄糖苷)和矢車菊素-3-(6-二乙二酰葡萄糖苷)。Cebadera-Miranda等[17]鑒定出‘桑吉耐洛’和‘塔羅科’血橙中10種花青素組分，主要包括7種矢車菊素和3種飛燕草素。曹少謙[18]利用高效液相色譜-質譜聯用技術鑒定出‘塔羅科’血橙中8種花青素物質，2種主要組分及6種次要成分。楊海健等[19]發現‘塔羅科’血橙果皮中主要有矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3(6''-丙二酰)葡萄糖苷和飛燕草素-3-蕓香糖苷3種花青素。

塔羅科血橙是我國主栽血橙品種，果肉色澤是其關鍵品質指標之一，花青素含量高低決定其商業價值，但在重慶地區血橙表現出果肉著色淺或不均勻、品質下降等問題，制約產業發展。目前，高花青素商業血橙品種匱乏，血橙花青素代謝調控機制研究尚不透徹。液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）因分辨率高、靈敏度高，適合檢測高沸點、高分子質量化合物、熱不穩定物質等，在植物代謝組學方面的應用越來越廣泛[20-21]。本研究基于LC-MS/MS技術測定‘塔羅科’血橙優系和對照品種果肉花青素代謝物的種類和含量，篩選兩者的差異代謝物，為優系后續基礎應用研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試品種為‘塔羅科’血橙優系，系本實驗室前期從普通‘塔羅科’血橙中篩選的芽變材料，具有高花青素、高可溶性固形物含量兩大優良性狀。供試材料‘塔羅科’血橙優系和對照品種‘塔羅科’血橙種植于重慶市開州區鴻情香橙果園，海拔385 m，基砧均為枳，中間砧為錦橙，高接5年，普通管理水平。2月下旬果實成熟期采樣，選取‘塔羅科’血橙優系（G）和對照品種‘塔羅科’血橙（CK）各9 株樹，內膛（N）和外圍（W）分別采集果樣，設置GN、GW、CKN和CKW 4個實驗組，每個實驗組每株采集果實樣品5個，每3 株樣樹的15個果實混合為1個生物學樣品并設置3個重復，用于果實基礎品質和花青素代謝物測定。

甲醇（色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；鹽酸（優級純）信陽市化學試劑廠；標準品：矢車菊素類（矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-桑布雙糖苷、矢車菊素-3-O-槐糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、矢車菊素-3,5-O-二葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-桑布雙糖苷-5-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷-5-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-對香豆酰葡萄糖苷、矢車菊素-3-(6-咖啡酰)-葡萄糖苷、矢車菊素-3-(6-咖啡酰槐糖苷)-5-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-5-O-(6-O-對香豆酰)二葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿魏?；碧擒?5-葡萄糖苷、矢車菊素-3,5,3'-O-三葡萄糖苷）、黃酮類（柚皮素-7-O-葡萄糖苷、蘆丁、柚皮素、查耳酮、二氫楊梅黃酮、阿福豆苷、香橙素（二氫山柰酚）、異槲皮苷）、錦葵色素類（錦葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-阿拉伯糖苷、錦葵色素-3-O-對香豆酰葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-半乳糖苷、錦葵色素-3-O-葡萄糖苷、錦葵色素、錦葵色素-3-O-5-O-(6-O-對香豆酰)-二葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-(6''-乙酰基葡萄糖苷)-5-葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-蕓香糖苷、錦葵色素-3-O-桑布雙糖苷、錦葵色素-3-O-槐糖苷、錦葵色素-3-O-桑布雙糖苷-5-葡萄糖苷）、原花青素類（原花青素A1、原花青素A2、原花青素B1、原花青素B2、原花青素B3、原花青素C1）、芍藥花色素類（芍藥花色素-3-(咖啡酰葡萄糖基葡萄糖苷)-5-葡萄糖苷、芍藥花素-3-O-對羥基苯甲酰槐糖-5-葡萄糖苷、芍藥花色素-3-O-咖啡酰-阿魏酰-槐糖苷-5-葡萄糖苷、芍藥花色素-3-O-阿魏酰-槐糖苷-5-葡萄糖苷、芍藥花色素-3-O-桑布雙糖苷-5-葡萄糖苷、芍藥花素-3,5,3'-O-三葡萄糖苷、芍藥花色素、芍藥花色素-3-O-5-O-(6-O-對香豆酰)-二葡萄糖苷、芍藥花色素-3-O-桑布雙糖苷、芍藥花色素-3-O-槐糖苷、芍藥花色素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、芍藥花色素-3-(6-p-對香豆酰)-葡萄糖苷、芍藥花色素-3-O-葡萄糖苷、芍藥花色素-3-O-半乳糖苷、芍藥花色素-3-O-蕓香糖苷、芍藥花色素-3,5-O-二葡萄糖苷、芍藥花色素-3-O-阿拉伯糖苷）、飛燕草素類（飛燕草素-3-O-乙?；咸烟擒铡w燕草素-3-O-(6-O-丙二?；?-葡萄糖苷-3'-葡萄糖基、飛燕草素、飛燕草素-3-O-對香豆酰葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-5-O-(6-O-對香豆酰)二葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素-3-O-蕓香糖苷、飛燕草素-3-O-槐糖苷、飛燕草素-3,5-O-二葡萄苷、飛燕草素-3-蕓香糖苷-5-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-鼠李糖苷、飛燕草素-3-O-桑布雙糖苷、飛燕草素-3-O-桑布雙糖苷-5-葡萄糖苷）、天竺葵素類（天竺葵素、天竺葵素-3-O-對香豆酰葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-(6''-阿魏酰桑布雙糖苷)-5-O-(丙二?；?-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-5-O-(6-O-對香豆酰)-二葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-[2-O-葡萄糖基-6-O-p-對香豆酰-葡萄糖苷]-5-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-阿拉伯糖苷、天竺葵素-3-O-半乳糖苷、天竺葵素-3-O-蕓香糖苷、天竺葵素-3-蕓香糖苷-5-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-桑布雙糖苷、天竺葵素-3-O-槐糖苷-5-O-(丙二酰基)-葡萄糖苷、天竺葵素-3-(6-咖啡?；碧擒?-5-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-阿魏酰葡萄糖基葡萄糖苷-5-葡萄糖苷、天竺葵素-3,5,3'-O-三葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-桑布雙糖苷-5-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-槐糖苷、天竺葵素-3,5-O-二葡萄糖苷）、矮牽牛素類（矮牽牛素-3,5-O-二葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-5-O-(6-O-對香豆酰)二葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-阿拉伯糖苷、矮牽牛素-3-O-半乳糖苷、矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷、矮牽牛素-3-O-桑布雙糖苷、矮牽牛素-3-O-槐糖苷、矮牽牛素-3-O-桑布雙糖苷-5-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖、矮牽牛素-3-O-對香豆酰葡萄糖苷）（純度＞99%） 上海isoReag公司。

1.2 儀器與設備

QTRAP 6500+LC-MS/MS聯用儀 美國SCIEX公司；5424R離心機 德國Eppendorf公司；AS 60/220.R2電子天平 波蘭RADWAG公司；MM400球磨儀德國Retsch公司；MIX-200多管渦旋振蕩器 上海凈信公司；KQ5200E超聲清洗儀 昆山舒美公司。

1.3 方法

上述4 組果實樣品中，設置CKN_vs_CKW、CKN_vs_GN、CKN_vs_GW、CKW_vs_GN、CKW_vs_GW、GN_vs_GW 6個不同的對比組篩選花青素差異代謝物。

1.3.1 果實品質指標分析

取10個大小均勻的果實，單果質量使用電子天平測定；可溶性固形物含量用手持糖度折光儀測定；可滴定酸含量采用酸堿滴定法測定；固酸比計算得出；總花青素含量采用試劑盒（蘇州格銳思生物科技有限公司）測定。

1.3.2 樣品前處理

將血橙于液氮條件下剝離的汁胞進行真空冷凍干燥，總量約為50 g；球磨儀（30 Hz，1.5 min）研磨至粉末狀；稱取50 mg粉末，溶解于500 μL提取液（50%甲醇溶液，含0.1%鹽酸），渦旋5 min，4 ℃、40 kHz超聲5 min，離心（12 000 r/min，3 min），吸取上清液，重復操作1次；將2次上清液合并，用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.3.3 色譜條件

ACQUITY BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：A為超純水（含0.1%甲酸），B為甲醇（含0.1%甲酸）；洗脫梯度：0.0～6.0 min，95%～50% A，5%～50% B；6.0～12.0 min，50%～5% A，50%～95%B；12.0～14.0 min，5% A、95% B；14.0～16.0 min，95%A、5% B；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

1.3.4 質譜條件

電噴霧離子源；溫度550 ℃；正離子模式下質譜電壓5 500 V；氣簾氣壓力35 psi。在LC-MS/MS聯用儀中，每個離子對是根據優化的去簇電壓和碰撞能進行掃描檢測。

1.3.5 標準曲線的繪制及樣本含量

配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL不同質量濃度的標準品溶液，獲取各個質量濃度標準品的對應定量信號的質譜峰強度數據；以標準品質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制不同物質的標注曲線，相關系數R大于0.99。樣本中代謝物的含量按下式計算：

式中：c為樣本中色譜峰的峰面積代入標準曲線得到的質量濃度/（ng/mL）；V為提取時所用溶液的體積/μL；m為稱取的樣本質量/g。

1.3.6 差異代謝物的篩選

項目計算差異倍數（fold change，FC），其表示兩對比組間表達量的比值，選取FC不小于2和FC不大于0.5的代謝物為最終差異代謝物。

1.4 數據處理

基于標準品構建MWDB（Metware Database）數據庫，對質譜數據進行定性分析；利用三重四極桿質譜的多反應監測模式完成定量分析。獲得樣本的質譜分析數據后，對所有物質的色譜峰進行積分，并對每種物質在不同樣本的質譜峰進行校正。利用Analyst 1.6.3處理質譜數據。并對樣本質控分析，檢測總離子流圖重疊性，以此判斷項目檢測期間儀器的穩定性。代謝組數據由武漢邁維代謝公司進行分析。

2 結果與分析

2.1 果實基礎品質分析及著色表現

由圖1可見，‘塔羅科’血橙優系果肉著色明顯優于對照組。品質分析數據見表1，‘塔羅科’血橙優系果實總花青素與可溶性固形物含量優勢顯著。其中，GW組花青素質量濃度最高（52.34 mg/L），GN組質量濃度次之（46.81 mg/L），CKN組花青素質量濃度最低（11.37 mg/L），GW組/CKW組、GW組/CKN組花青素含量比值分別約為2.07和4.60，而GW組/GN組比值約為1.12，表明‘塔羅科’血橙優系樹冠外圍和內膛果實中花青素含量均顯著高于對照，且優系外部和內膛之間差異較小；可溶性固形物含量GW組（14.1%）和GN組（13.4%）顯著高于CKW組和CKN組，優系和對照品種樹冠外圍果實的可溶性固形物含量均高于內膛，GW組果實的可滴定酸含量稍高于GN以及對照組，與對照品種相比，優系外圍與內膛果實的固酸比值接近。綜上，‘塔羅科’血橙優系果實關鍵品質性狀優良，且樹冠內外果實可溶性固形物、花青素含量高且差異較小。

圖1 ‘塔羅科’血橙優系與對照品種果實著色情況Fig. 1 Flesh color of the superior strain common ‘Tarocco’ blood orange

表1 果實品質指標測定結果Table 1 Fruit quality indexes of the superior strain common ‘Tarocco’blood orange

2.2 花青素定量定性分析

圖2 樣本總離子流色譜圖（A）、提取離子流色譜圖（B）、樣本總離子流色譜重疊圖（C）Fig. 2 Total ion current chromatogram (A), extracted icon chromatogram (B), and overlapped total ion current chromatograms (C)of anthocyanidins

如圖2所示，樣本質控總離子流色譜圖重疊性高，保留時間和峰強度均一致，表明檢測期間此儀器穩定，數據可信。

由表2可以看出，本實驗檢出的花青素代謝物分為矢車菊素（9種）、飛燕草素（6種）、芍藥花素（6種）、天竺葵素（3種）、矮牽牛素（3種）、錦葵素（2種）以及花青素合成前體物質黃酮（4種）7個類別?！_科’血橙優系共檢測出33種花青素代謝物，GN組和GW組數量一致；而對照品種‘塔羅科’血橙外圍和內膛果檢測出的花青素代謝物數量不一，CKW組和CKN組分別檢測出30種和27種，外圍果實檢出數量多于內膛。4 組果實共同存在的花青素代謝物為27種，相比對照品種‘塔羅科’血橙，芍藥花素-3-O-半乳糖苷、錦葵色素-3-O-丙二酰葡萄糖苷和柚皮素為GN和GW組特有的種類；4 組果實中主要花青素代謝物均為矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，兩者為血橙果肉呈色和色澤深淺的關鍵因子，在GN、GW、CKN和CKW組中含量分別為22.40（42.30%）、27.60（41.00%）、6.10（39.50%）、13.10 μg/g（41.00%）和21.50（40.60%）、27.90（41.40%）、5.68（36.80%）、13.00 μg/g（40.60%），矢車菊素類花青素總量在GN、GW、CKN和CKW組中分別為48.68（91.90%）、62.16（92.28%）、12.79（82.89%）、28.16 μg/g（88.03%），‘塔羅科’血橙優系果實中矢車菊素類花青素絕對含量和占比均顯著高于對照品種，飛燕草素、芍藥花素以及黃酮類代謝物絕對含量也高于對照品種，但占比低于對照品種。GN和GW組矢車菊素、飛燕草素、芍藥花素以及黃酮4 類代謝物占各自花青素總量的百分比相近?；ㄇ嗨亟^對定量結果顯示，GW和GN組的花青素代謝物含量均顯著高于CKW和CKN組，GW組花青素代謝物含量最高，約67.37 μg/g，為CKN組的4.37 倍，GN組次之，CKW組約為CKN組的2.07 倍，與總花青素測定結果吻合。

表2 絕對定量結果Table 2 Anthocyanidin metabolite contents in blood organge

2.3 聚類分析

圖3 聚類熱圖分析Fig. 3 Heatmap of cluster analysis

采用極差法對代謝物含量數據進行歸一化處理，通過R語言對4 組果實花青素代謝物進行聚類熱圖分析。如圖3所示，顏色越紅表示含量越高，各組間差異明顯。GW組整體以紅色為主，矢車菊素、飛燕草素、芍藥花素、天竺葵素、矮牽牛素、錦葵素等花青素含量較高；而CKN組偏向于綠色，總體含量較低，上述結果表明‘塔羅科’血橙優系花青素含量較對照品種高，與果實品質分析結果一致。然而，并非檢測出的所有物質均以GW組含量最高，如CKN組山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量最高，CKW組最低；GN組芍藥花色素-3-O-蕓香糖苷、矮牽牛素-3-O-對香豆酰葡萄糖苷含量最高，CKN組未檢出；蘆丁、錦葵色素-3-O-對香豆酰葡萄糖苷在CKW組含量最高，GN組最低。

2.4 差異代謝物篩選

如表3所示，CKN_vs_GN和CKN_vs_GW對比組的差異代謝物最多，同為14種，且差異代謝物的種類相同，分屬矢車菊素、飛燕草素、芍藥花色素、天竺葵素和黃酮5 類物質；CKW_vs_GN對比組中差異代謝物為6種，分屬矢車菊素和天竺葵素2 類物質；CKW_vs_GW對比組差異代謝物為12種，分屬矢車菊素和芍藥花色素2 類物質；CKN_vs_CKW對比組差異代謝物為9種，分屬矢車菊素、飛燕草素、芍藥花色素和黃酮4 類物質；GN_vs_GW對比組中無差異代謝物。上述結果表明該‘塔羅科’血橙優系中花青素的合成可能不受空間的影響。此外，除GN_vs_GW對比組外，其余對比組差異代謝物均上調。

表3 差異代謝物統計數目Table 3 Statistics of differential metabolites between different groups

圖4 不同對比組差異代謝物差異倍數條形圖Fig. 4 Fold changes of differential metabolites between different groups

如圖4所示，除GN_vs_GW組外，其他對比組差異代謝物均上調。CKN_vs_CKW對比組中，柚皮素-7-O-葡萄糖苷和芍藥花素-3-O-葡萄糖苷上調明顯，差異倍數為8.98和5.76（圖4A）。CKN_vs_GN和CKN_vs_GW兩個對比組中，上述2種物質也均上調，FC分別為11.88、10.38和16.70、13.22（圖4B、C）。CKW_vs_GN和CKW_vs_GW對比組中，上調倍數前兩位的物質為芍藥花素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-桑布雙糖苷，上調倍數分別為4.72、3.60和8.65、4.46（圖4D、E）。

進一步將6個對比組進行組間共有和特有的差異代謝物信息分析，見圖5。CKN_vs_GN和CKW_vs_GW對比組共有矢車菊素、芍藥花素、天竺葵素類差異代謝物11種，其中矢車菊素有8種（圖5A）；CKN_vs_GW和CKW_vs_GN對比組共有差異代謝物5種，均為矢車菊素類（圖5B）；CKN_vs_CKW和GN_vs_GW對比組沒有交集（圖5C）。以上結果說明了矢車菊素是‘塔羅科’血橙優系與對照‘塔羅科’血橙果肉呈色的花青素主要差異代謝物質基礎，同時也表明了2個品種花青素的積累特性存在明顯差異。

圖5 不同對比組共有差異代謝物Venn圖Fig. 5 Venn charts showing shared differential metabolites between different groups

2.5 KEGG通路分析

差異代謝物在生物體內相互作用，形成不同的通路。利用KEGG數據庫對不同對比組的差異代謝物進行注釋，CKN_vs_CKW、CKN_vs_GN、CKN_vs_GW對比組中在花青素合成途徑中分別被注釋6、9、9種物質，占比為85.71%、90%、90%（圖6A、B）；CKW_vs_GN在植物代謝、次生生物代謝及花青素合成途徑注釋的代謝物數目分別為1、1、4，所占比例為20%、20%、80%；CKW_vs_GW對比組中上述3 條途徑注釋數目為1、1、8，所占比例為11.11%、11.11%和88.89%（圖6C、D）。

圖6 不同對比組差異代謝物KEGG分類圖Fig. 6 KEGG classification of differential metabolites between different groups

不同對比組篩選的差異代謝物映射到3 條通路：ko00942花青素合成、ko01100植物代謝和ko01110次生代謝合成。代謝通路共映射14種物質，分別為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-槐糖苷、矢車菊素-3-O-桑布雙糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷、天竺葵素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-丙二酰葡萄糖苷和芍藥花素-3-O-葡萄糖苷。其中ko00942通路的差異代謝物最多，共有14種物質，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷參與了3 條代謝通路。

3 討 論

血橙作為柑橘類唯一含花青素的品種，具有較高的營養與保健價值，已成為育種者關注的熱點品種之一?；ㄇ嗨赜捎谄渥匀唤鐏碓磸V、生理功能豐富和抗病機理獨特的特性，具有很高的研究價值[6,22]。比如矢車菊素-3-葡萄糖苷，是自然界最常見的花色苷，進入體內后較容易被吸收，其降解代謝產物多達41種，可減少體內炎性物質的產生，降低心血管疾病等慢性疾病的風險[23]。此外，花青素還可應用于食品、藥品和化妝品等行業，花青素在抗癌和抗氧化[22]、抗炎和抗肥胖[24]、治療青光眼和保護視力[25]等方面也具有作用，深受醫藥工作者青睞。馬越等[26]發現由黑加侖濃縮汁、蘋果濃縮汁調配而成的花青素飲料，可有效緩解視疲勞。

已有研究表明低溫易促進花青素苷的合成，高溫加速花青素苷的分解[27]。黃冬華等[28]發現適宜低溫刺激可促進富貴籽果實的著色，方鵬[29]研究發現‘紅陽’獼猴桃在高溫脅迫下花青素易降解，果實難以著色。血橙是以冷誘導的方式在果肉中積累花青素，其果皮在充足的光照條件下也能積累花青素。血橙Ruby1啟動子是花青素合成的關鍵激活子，同時與光和低溫誘導相關，CsRuby1啟動子中的反轉座子LTR區在低溫誘導血橙果實花青素積累的過程中發揮核心調控作用[13]。短時低溫刺激也能促進血橙采后貯藏期間花青素合成通路相關基因CHS、DFR、ANS、UFGT、GST的表達上調，增強花青素的合成[30]。相較樹體外圍而言，內膛的溫度較高且變化幅度較小。本實驗中對照品種‘塔羅科’血橙內膛（11.37 mg/L）和外圍（25.21mg/L）果實總花青素含量差異顯著，其受到溫度的影響較大，而‘塔羅科’血橙優系的可溶性固形物和總花青素含量明顯高于對照品種，其外圍（52.34 mg/L）與內膛（46.81 mg/L）果實的花青素含量接近，且內外果實中矢車菊素、飛燕草素、芍藥花素以及黃酮4 類代謝物占各自花青素總量的比例相當，與對照品種也有明顯差異，充分展現了‘塔羅科’血橙優系果實花青素積累的獨特性，推測其果實中花青素合成對于低溫的響應機制可能不同于對照品種。

通過測定分析結果表明，本實驗中‘塔羅科’血橙優系和對照品種果實花青素組分主要為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷，與前人研究結果一致[15-16]。相比對照，‘塔羅科’血橙優系果實中矢車菊素類物質絕對含量和總花青素占比均顯著提高，其內膛和外圍果實矢車菊素類花青素總量為48.68 μg/g（91.90%）和62.16 μg/g（92.28%）。在優系中矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量比值接近1，而在對照品種中，內膛果矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷含量約為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的1.07 倍，外圍果實比值約為1；而在‘桑吉耐洛’、‘T. Ippolito’和‘T. Rosso’血橙上研究發現矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷含量約為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的1.09～1.75 倍[17]，曹少謙[18]則發現‘塔羅科’血橙上發現上述2種矢車菊素類物質含量比值約為0.82，與本實驗2個品種的結果有差異，這可能與品種特性或是栽培條件差異緊密相關?！_科’血橙優系樹體內膛和外圍果實無差異代謝物，對照品種內膛和外圍果實中有9種差異代謝物且均為上調代謝物，上述結果表明該‘塔羅科’血橙優系中花青素的合成可能不受果實在樹體中著生方位的影響。芍藥花素-3-O-半乳糖苷、柚皮素、錦葵色素-3-O-丙二酰葡萄糖苷3種物質是優系較對照品種特有的花青素相關代謝物質。值得關注的是，本實驗中在對照品種中內膛與外圍果實花青素合成前體物質黃酮在總花青素含量中的比例（分別為7.76%和4.80%）明顯高于優系品種，推測相比對照品種，優系花青素合成通路的結構基因表達水平更高，其下游合成轉化能力更強。此外優系中還特有的芍藥花色素、錦葵色素，這可能是優系果肉呈現更深紫紅色的原因。

根據KEGG通路結果顯示，不同對比組篩選的差異代謝物參與植物代謝、次生代謝、花青素合成3 條途徑，共14種差異代謝物，主要分為矢車菊素、飛燕草素、芍藥花素和天竺葵素類物質。本實驗發現天竺葵素-3-O-葡萄糖苷參與到三條代謝通路中，但該物質含量甚少。先前研究表明天竺葵素-3-O-葡萄糖苷為草莓中主要的色素，可依據該物質的有無，對草莓進行分類[31]。此外，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷還可影響金花茶組植物花色的鮮艷程度[32]。目前該物質在柑橘中尚未發現相關的細致研究。植物代謝途徑網絡交錯復雜，不同對比組所篩選的差異代謝物在代謝途徑扮演的角色還需進一步深入研究。

4 結 論

利用LC-MS/MS技術共檢測出‘塔羅科’血橙優系及對照品種果實花青素代謝物共33種，主要成分均為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷?！_科’血橙優系較普通品種花青素含量高且代謝物種類多，優系的內膛和外圍果實分別檢測出33種花青素代謝物，且二者無差異代謝物，上述結果表明該‘塔羅科’血橙優系中花青素的合成可能不受空間的影響；而對照品種‘塔羅科’血橙內膛和外圍果實花青素代謝物分別檢測出27種和30種，差異代謝物達9種且均為上調代謝物。相比對照，‘塔羅科’血橙優系具有花青素和可溶性固形物含量高、內外膛著色差異小的顯著優勢，該品種花青素的合成機制及開發利用仍有待后續深入研究。