一種羊乳粉的微滴式數字PCR定量分析方法

陳 晨，史國華，張 瑞，張 濤，嚴陶陶，陳勃旭，張子侖，張 巖，周 巍,2,*

（1.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050071；2.河北師范大學生命科學學院，河北 石家莊 050024）

羊乳由于其營養成分中脂肪酸組成、含氮量、蛋白組成相比較于牛乳更貼近母乳[1-3]而被廣大消費者喜愛，素有“奶中之王”的美譽。羊乳中不含牛乳中的αS1-酪蛋白、β-乳球蛋白等容易引起人體過敏的物質，更適合消費群體的需求，降低了易敏人群的致敏的風險。羊奶粉目前處于整體品類上升期，仍處于初級階段，目前市場份額占比僅占乳品行業的4%，還有很大的發展空間，由于羊奶其獨特的營養價值，越來越多的廠家進軍羊奶粉市場，對牛奶粉形成了劇烈沖擊，但奶羊的養殖區域的限制，奶羊上游產業仍需要較長時間才能建成，制約了羊奶粉產業的生長。市場上以牛乳冒充羊乳的商品欺詐現象時有發生，這不僅對市場造成影響，更因牛乳中含有易致敏的營養物質，增加了消費者的風險，嚴重危害了消費者的健康。

近幾年，食品行業已經成為國民經濟的支柱行業，食品安全事件也層出不窮，現在日益全球化的生產鏈使得食品摻假變得容易[4]，食品摻假不僅會讓消費者喪失對市場監管部門的信任，還會對消費者的健康造成威脅，如出現痙攣、過敏甚至癱瘓現象[5-6]。目前市場上乳品的消費已經不再局限于新生兒的范疇，也是成年人及兒童重要營養物質的來源[7-8]。隨著乳制品全球化的迅猛發展，一些生產商為降低生產成本，追求經濟利益，在其中加入一些摻假物質，最為常見的為三聚氰胺，但假蛋白的加入會使摻假者面臨查處的風險。為使得摻假產品達到真實的效果，生產商采用隱蔽性更強且同源的摻假形式，其中最為代表性的就是羊乳中加入牛乳降低成本[9-11]。目前鑒定乳源的方法有理化方法[12-15]、免疫技術[16-19]、基因方法[19-24]、蛋白檢測[25-29]等，由于羊乳粉含量復雜，常用檢測方法具有一定的局限性，數字聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）克服了傳統方法操作復雜的弊端，更加準確地進行了定量檢測。

數字PCR是現代新型的核酸絕對定量技術，是將其含有核酸模板的體系進行微滴化處理，進而進行PCR，反應結束后檢測熒光信號進而分析出樣品中核酸的濃度。該技術計算的是核酸的最原始的濃度，不再依賴標準曲線及標準品。Floren等[30]應用微滴式數字PCR技術對牛、馬、豬源進行了定量檢測。苗麗等[31]利用微滴式數字PCR技術建立了羊肉質量和拷貝數的關系。楊碩等[32]采用多重微滴式數字PCR完成了核桃露中核桃、大豆成分的物種定量鑒定。本研究建立了微滴式數字PCR技術對羊乳粉的定量檢測方法研究，通過質量、DNA質量濃度、拷貝數，以DNA質量濃度為中間值，建立拷貝數與質量的關系式，再通過摻假模型進行實驗方法的驗證。以期為建立羊乳粉摻假的市場監管標準研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊乳粉購自陜西羊乳粉企業。

深加工食品DNA提取試劑盒（非離心柱型）天根生化科技（北京）有限公司；氯仿 北京酷來博科技有限公司；無水乙醇、異丙醇（均為分析純）天津市科密歐化學試劑有限公司；ddPCRTMSupermix for Probes（no dUTP）、Droplet Generation Oil for Probes、ddPCRTM Droplet Reader Oil 美國Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設備

ME204/02電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器 常州潤華電器有限公司；Sigma 3K15冷凍離心機 德國Sigma公司；NanoDrop 2000微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo公司；LightCycler 480II實時熒光定量PCR儀 德國羅氏診斷有限公司；C1000 Touch Thermal Cycler PCR擴增儀、PCR Plate Sealer、QX200 Droplet Generator、QX200Droplet Reader、QX200 Droplet Generator、DG8 cartridge微滴生成卡、Holder微滴發生器 美國Bio-Rad公司；冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

采用改良版的深加工食品DNA提取試劑盒，稱取5～100 mg，加1 000 μL緩沖液GMO1和40 μL的蛋白酶K（20 mg/mL），渦旋振蕩1 min。60 ℃孵育2 h。孵育過程中始終保持振蕩。將孵育好的樣本分別加入GMO2和三氯甲烷，加入量為200、400 μL，渦旋振蕩1 min，靜置10 min。在4 ℃、12 000 r/min離心5 min，轉移上清液至新離心管中，并加入0.7 倍體積的異丙醇，充分混勻。在4 ℃、12 000 r/min離心3 min，去上清液留沉淀。加入700 μL 70%乙醇溶液，渦旋振蕩5 s，在離心機上以12 000 r/min離心2 min，去除上清液。重復此步驟一次。開蓋，在生物安全柜中，打開抽風放置20 min，徹底晾干殘留乙醇。向其中加入洗脫緩沖液TE 30 μL，渦旋1 min，并測定DNA含量和純度。

1.3.2 引物探針

由于羊乳粉存在物種間的差異性，選用針對綿羊和山羊都有效的特異性探針進行檢測，引物和探針引用自[33]，見表1，結果顯示該探針與其他物種間不存在交叉反應，特異性強，可應用于后續實驗。

表1 羊引物探針Table 1 Sheep-specific primer and probe sequences

1.3.3 微滴式數字PCR

1.3.3.1 微滴式數字PCR反應條件

數字PCR反應條件包括2×ddPCR Super Mix為10 μL、上游引物用量為1.2 μL（10 μmol/L）、下游引物用量為1.2 μL（10 μmol/L）、探針用量為0.4 μL（10 μmol/L）、DNA模板為4.0 μL、ddH2O補齊20 μL體系。

反應程序為：95 ℃預變性10 min；94 ℃變性1 min；56 ℃退火45 s；進行40個循環，98 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.3.3.2 微滴式數字PCR操作步驟

1）先將所需實驗模板按一定梯度進行稀釋，制成實驗樣品轉移到微滴發生卡中，同時加入微滴發生油70 μL，進行微滴的制備。2）將制備好的微滴轉移到96 孔板中，應用封膜儀進行封膜處理。3）將封好膜的96 孔板，放到C1000 Touch Thermal Cycler PCR擴增儀中擴增。4）擴增結束后將96 孔板放到QX200 Droplet Reader中，根據實際實驗排版進行信息錄入，讀取實驗結果，根據微滴發出的熒光信號的強度判定陽性和陰性結果，并記錄下每個樣品的陽性和陰性的微滴數。信號采集完畢后，軟件Quantasoft將計算出最終結果并以圖像形式給出。

1.3.4 特異性檢測

微滴式數字PCR檢測分別用羊乳粉、牛乳粉、駱駝乳粉、馬乳粉、驢乳粉、豬、雞、鴨、核桃、杏仁、花生、大豆的基因組DNA作為特異性檢測的擴增對象，無菌雙蒸水作為空白對照，每個樣本設置兩個平行。

1.3.5 質量與拷貝數關系曲線的建立

1.3.5.1 羊乳粉質量與提取DNA質量濃度的關系

稱取羊乳粉10～180 mg不同質量的實驗樣本，進行不同質量實驗樣本的DNA提取，每個質量重復4次，減少實驗誤差，經Nanodrop 2000測定DNA的含量，從而建立質量和其DNA質量濃度之間的關系。

1.3.5.2 羊乳粉DNA質量濃度與數字PCR拷貝數關系的建立

將提取得到的羊乳粉基因組DNA進行系列稀釋，稀釋梯度為5、10、20、40、60、80、100 ng/μL，每個梯度設置3個重復，為得到準確的拷貝數，需對其稀釋的精確性有較高要求，以無菌雙蒸水作為對照，通過進行微滴式數字PCR檢測得到DNA含量和拷貝數的關系。

1.3.6 建立摻假模型及市售樣本的檢測

在羊乳粉摻假模型的建立中，羊乳粉為主要被摻假對象，構成摻假模型，摻假模型以100 mg為最大摻假質量進行設計，摻假比例為5∶95、10∶90、20∶80、40∶60、60∶40、80∶20、100。之后將摻假的實驗樣本進行DNA的提取，并將提取好的基因組DNA進行10 倍稀釋，取4 μL進行微滴式數字PCR的檢測，得到的結果通過公式推算出實際值和測量值的差異，進而衡量所建立公式的準確性。

為進一步驗證實驗的準確性，本研究在市場上購買了一批標簽顯示為羊乳粉的商品進行測試，市售樣本的測試均保證與實驗樣本操作過程一致，減小誤差，每個樣本設置3個平行。

1.4 數據分析

所有結果采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，利用Excel進行圖表編輯。

2 結果與分析

2.1 特異性檢測

基于微滴式數字PCR技術，選取羊乳粉、牛乳粉、駱駝乳粉、驢乳粉、馬乳粉及豬、雞、鴨、核桃、杏仁、花生、大豆的基因組DNA作為特異性檢測對象，結果顯示本實驗羊的引物探針特異性良好，可應用于后續實驗，具體實驗結果見圖1。

圖1 羊乳粉特異性圖譜Fig. 1 Specificity map of goat milk powder

2.2 提取質量、含量及拷貝數的關系曲線

為探索羊乳粉質量與DNA含量的關系，稱取不同質量羊乳粉10～180 mg，對其進行基因組DNA提取，經測量得到不同質量梯度下的DNA質量濃度，進而得到質量濃度（y）與質量（x）的關系曲線，結果見表2，在稱取的質量范圍內質量與質量濃度呈良好的線性關系，y＝5.175 4x+3.839 4，R2＝0.992 7，說明實驗結果具有一定的可信性。羊乳粉DNA質量濃度梯度圖譜見圖2。

表2 羊乳粉DNA提取結果Table 2 Results of DNA extraction from goat milk powder

圖2 羊乳粉DNA質量濃度梯度圖譜Fig. 2 DNA concentration gradient map from goat milk powder

統計學中規定變異系數小于15%，數據可靠。分析每個梯度各重復間羊乳粉DNA含量的最大變異系數為10.65%，所以數據具有可信性。將提取的基因組DNA分別稀釋為5、10、20、40、60、80、100 ng/μL，取4 μL稀釋后的DNA進行數字PCR檢測，進行3次重復，結果見表3，取DNA拷貝數的平均值（y）與DNA質量濃度（x）進行線性擬合，y＝1.717 3x+2.149 3，R2＝0.998 1，結果顯示兩者的線性關系良好。

表3 羊乳粉DNA含量與拷貝數結果Table 3 DNA concentration and copy number from goat milk powder

2.3 質量與拷貝數公式的建立

根據2.2節曲線結果，以DNA含量為中間值進行換算時，DNA質量濃度先經過了10 倍稀釋，再取4 μL進行計算，由此得到羊乳粉質量與DNA拷貝數之間的計算公式。M＝（C-4.75）/3.56，其中，M為羊乳粉質量（mg），C為DNA拷貝數（copies/μL）。

2.4 摻假模型的數字PCR檢測

在羊乳粉摻假模型中，共設置7個不同的摻假比例，并對其樣本進行基因組DNA的提取，并將提取的基因組DNA進行10 倍稀釋，取4 μL進行上機實驗，設置3個重復，并分析個各重復間的變異系數，并將拷貝數的平均值代入公式中進行計算得到目標物種的質量，統計學中規定變異系數小于15%，數據可靠，本摻假模型中變異系數最大為11.27%，所得結果均在統計學許可范圍內。摻假模型的檢測結果驗證了本研究所建立的定量方法具有一定的準確性，可應用于市售羊乳粉的檢測。具體結果見表4、圖3。

表4 已知摻假比例的分析結果Table 4 Results of analysis of known adulteration levels

2.5 市售樣本的數字PCR檢測

在進行引物引用時考慮到了不同物種的羊的差異性，引證文獻及本實驗均進行了羊源性成分引物和探針的種內包容性和種間特異性，所以應用本實驗建立的羊乳粉的微滴式數字PCR檢測方法，對市場上標簽為羊乳粉商品進行檢測，市售羊乳粉的處理方法同摻假模型的方法一致，由表5可知，在檢測的20 批次市售羊乳粉中，1 批次樣本明顯跟標簽不符，標明是羊乳粉但實際檢測羊乳粉含量為0，其他批次的樣本中多少也存在一定的摻假現象。

表5 市售羊乳粉樣本分析Table 5 Results of analysis of commercially available samples

3 結 論

采用微滴式數字PCR技術對羊乳粉進行摻假定量檢測，通過羊乳粉的質量及其DNA含量，DNA含量及其擴增DNA拷貝數之間的線性擬合關系，得到羊乳粉質量和擴增DNA拷貝數的計算公式，從而可以快速鑒別羊乳粉的摻假情況。

為進一步驗證方法的準確性，構建羊乳粉摻假模型，計算羊乳粉的實際摻入量，經擴增得到的實驗值和實際加入的摻假質量相差不大，最大變異系數為11.27%，小于統計學中規定的15%的范圍，且摻假模型中羊乳粉數據變異系數遠小于規定值，說明數據具有一定的可靠性。

為驗證本研究的市場應用價值，對羊乳粉市售樣本進行微滴式數字PCR技術的檢測。11 批次羊乳粉市售樣本均存在摻假現象，結果表明市場上存在一定羊乳粉摻假，同時也證明該方法具有一定的實際應用能力。羊乳粉相對于牛乳粉來說，具有巨大的商業價值，羊乳粉適用人群廣，價值高是現在受市場青睞的原因，實驗結果表明，市場上存在為牟取不正當利益，利用牛乳粉充當羊乳粉的現象，從定量的角度進行摻假檢測能更好地鑒別是人為摻假還是無意沾染，檢測的結果能準確得知摻假的質量，進一步驗證了該方法的準確性和實用性，能更加有利于市場監管部門的監管，為其提供技術支持。

綜上所述，微滴式數字PCR技術能夠準確進行羊乳粉的定量檢測，這為市場上羊乳粉摻假定量問題提供了一種技術手段，同時本研究也為除羊乳粉之外的其他乳粉定量檢測提供了一種檢測方向，健全了定量檢測體系。