構建氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測食品中蘇丹紅

盧春霞，閆圣坤，劉成江，林祥群，王雙慧，馮曉汀

（1.長江師范學院現代農業與生物工程學院，重慶 408100；2.新疆農業科學院農業機械化研究所，新疆 烏魯木齊 830091；3.新疆農墾科學院農產品加工研究所，新疆 石河子 832000；4.新疆石河子職業技術學院，新疆 石河子 832000）

蘇丹紅是一種人工合成的親脂類偶氮染料，主要包括蘇丹紅I、II、III、IV 4種類型。由于其增色效應顯著，常被作為非法添加劑用于改良番茄、辣椒等產品外觀，直接或間接危害人體健康。蘇丹紅被國際癌癥研究機構列為三類致癌物，其中蘇丹紅III的初級代謝產物4-氨基偶氮苯被列為二類致癌物[1]。我國及歐盟嚴禁將蘇丹紅作為色素添加劑在食品和飼料中使用。除了人為添加，一些農產品在生產過程中由于環境污染、肥料、農藥和塑料包裝等不規范使用以及一些不明因素，導致其一定程度上受到蘇丹紅交叉污染[2]。因此，準確、靈敏、快速地檢測食品中蘇丹紅染料的方法對食品安全監管有著十分重要意義。

目前，蘇丹紅檢測方法主要包括儀器分析方法，如高效液相色譜法[3]、液相色譜-質譜聯用等技術[4]。色譜與質譜技術靈敏度較高、結果可靠，但樣品預處理復雜、檢測成本高、有機溶劑用量大、且儀器設備昂貴，需要專業的操作人員。免疫分析方法[5]是應用較為廣泛的快篩檢測方法，與儀器分析法相比具有特異性強、操作簡單、靈敏度高等優點，但抗體制備周期長，成本較高。

核酸適配體是與靶分子特異性結合的一段單鏈DNA或RNA，由指數富集配體系統進化技術從隨機單鏈寡核苷酸庫中篩選獲得。適配體與靶標結合時可折疊成發夾、莖環、假結體及G-四鏈體等結構，通過氫鍵、范德華力和堿基堆積等作用進行分子識別。基于隨機文庫的龐大庫容和單鏈核苷酸空間結構的多樣性，適配體幾乎可以與所有種類的靶標[6-12]發生結合。與傳統的抗體相比，核酸適配體具有不受免疫原限制、可人工合成、成本低廉、應用范圍廣、易于標記和保存等優點。因此，適配體作為新型識別探針在食品分析領域得到廣泛研究和應用[13-15]。

在常規比色檢測中，納米材料和生物酶常作為發光信號標記在識別探針上。但是這種標記方法耗時耗力，且天然酶成本高，對保存環境要求高。血紅素/G-四鏈體DNA酶則是近年來迅速發展起來的一種人工合成的DNA酶。富含鳥嘌呤堿基（G）的DNA序列通過氫鍵作用折疊成特殊的G-四鏈體結構，當與氯化血紅素結合后，形成一種具有過氧化物酶活性的DNA酶，能催化H2O2氧化3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）或2'-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二胺鹽（2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS），生成藍色TMB+或綠色ABTS陽離子自由基。與天然酶相比，該酶熱穩定性高、價格便宜、合成簡單、易于標記，被廣泛應用于生物傳感器領域[16]。由于食品樣品成分復雜、干擾大，基質效應可能影響檢測靈敏度。為實現對靶標的高靈敏檢，有研究者將G-四鏈體DNA酶與雜交鏈式反應（hybridization chain reaction，HCR）相結合，構建生物傳感器應用于生物標記物、微生物、毒素、金屬離子等檢測[17-18]。但目前尚未見到基于適配體識別-氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶檢測蘇丹紅的研究報道。

本研究以蘇丹紅III適配體為識別元件，以氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶為信號探針，結合HCR信號放大策略構建一種比色生物傳感器。檢測原理如圖1所示，該傳感器由一個檢測探針和兩個發夾DNA探針（H1和H2）組成，檢測探針由蘇丹紅III適配體序列、觸發HCR反應的啟動序列，以及與適配體互補的序列組成，H1和H2包括非活性構型的G-四鏈體序列作為功能元件。無靶標時，檢測探針形成發夾折疊結構，無法引發HCR反應，當靶標結合適配體后打開檢測探針引發HCR反應，生成大量富G-四鏈體的雙鏈DNA納米線，加入血紅素后，形成具有過氧化物酶活性的氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶，催化H2O2氧化底物并顯色。構建的傳感器可用于簡單、靈敏、快速地進行蘇丹紅比色檢測，為食品中蘇丹紅的檢測提供一定的技術支撐。

圖1 基于氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色測定蘇丹紅示意圖Fig. 1 Schematic illustration of colorimetric detection of Sudan based on hemin/G-quadruplex DNAzymes

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火鍋料、辣椒醬、辣椒粉均購于本地超市。

蘇丹紅I（CAS號842-07-9）、蘇丹紅II（CAS號3118-97-6）、蘇丹紅III（CAS號85-86-9）、蘇丹紅IV（CAS號85-83-6）、對位紅（CAS號6410-10-2）、日落黃（CAS號2783-94-0）標準品 上海安譜實驗科技股份有限公司；牛血清白蛋白、二甲基亞砜、氯化血紅素、吐溫-20、TMB顯色試劑盒、HgCl2、Pb(NO)2、CdCl2、AgNO3生工生物工程（上海）股份有限公司；鏈霉親和素包被的酶標板 蘇州海貍生物醫學工程有限公司；其余常規試劑均為國產分析純。實驗用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）。

用乙腈將蘇丹紅配制成質量濃度為100 μg/mL的蘇丹紅原液，置于-20 ℃避光保存。使用時用pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（含8 g NaCl、0.2 g KCl、0.24 g KH2PO4、1.44 g Na2HPO）稀釋蘇丹紅原液至所需的質量濃度。

將氯化血紅素溶于二甲基亞砜中配制成5 mmol/L的氯化血紅素原液，置于4 ℃避光保存。使用時用PBS稀釋至所需濃度。

生物素化檢測探針由蘇丹紅III核酸適配體[19]和觸發HCR反應的啟動序列組成；發夾DNA探針在5'（或3'）和3'（或5'）端分別含有3/4和1/4的G-四鏈體序列[20]；探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其堿基序列見表1。

表1 檢測探針及發夾DNA探針序列Table 1 Sequences of the detection probe and hairpin DNA probes

1.2 儀器與設備

5MX 96 孔板混勻儀 美國賽洛捷克公司；Mk3酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司；MS3 basic渦旋混合器德國IKA公司；Milli-QReference超純水系統 美國密理博公司；5424R臺式冷凍離心機 德國艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器測定蘇丹紅III

鏈霉親和素包被的酶標板使用前用PBST溶液（0.05%吐溫-20+PBS）洗滌3次，加入100 μL 80 nmol/L生物素化檢測探針，室溫孵育20 min。PBST溶液洗滌3次，加入質量分數為5%的牛血清白蛋白溶液，封閉2 h，PBST洗滌后備用。將100 μL一定質量濃度的蘇丹紅III標準品加入到酶標板，室溫孵育30 min，PBST洗滌。H1和H2使用前于95 ℃加熱5 min，然后緩慢冷卻至室溫。分別向酶標板中加入50 μL 400 nmol/L的H1和H2，37 ℃孵育60 min。PBST洗滌后加入100 μL 0.8 μmol/L氯化血紅素，室溫孵育30 min。PBST洗滌，加入100 μL TMB底物（含H2O2），室溫孵育5～8 min后，加入100 μL 1 mol/L HCl溶液停止反應。通過顏色變化定性檢測蘇丹紅，用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度。pH 7.4 PBS設置為空白對照。

1.3.2 檢測條件優化

采用單因素優化試驗分別優化檢測探針濃度、靶標與適配體結合時間、H1和H2濃度、HCR反應時間、氯化血紅素濃度、氯化血紅素/G-四鏈體反應時間的實驗條件。均以蘇丹紅III為待測靶標，固定其質量濃度為100 ng/mL。

1.3.2.1 檢測探針濃度優化

固定適配體與靶標結合時間50 min，發夾探針H1和H2濃度均為600 nmol/L、HCR反應時間2 h，氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L，氯化血紅素和G-四鏈體反應時間為60 min，設置檢測探針濃度分別為20、40、80、100、150、200 nmol/L，采用1.3.1節方法進行檢測，考察檢測探針濃度對檢測性能的影響。

1.3.2.2 靶標與適配體結合時間優化

采用上述優化條件，固定發夾探針H1和H2濃度均為600 nmol/L、HCR反應時間為2 h，氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L，氯化血紅素和G-四鏈體反應時間為60 min，設置適配體與靶標結合時間分別為10、20、30、60、100 min，采用1.3.1節方法進行檢測。

1.3.2.3 發夾探針濃度優化

采用上述優化條件，固定HCR反應時間2 h，氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L，氯化血紅素和G-四鏈體反應時間為60 min，設置發夾探針H1和H2濃度分別為50、100、200、400、600、800 nmol/L，采用1.3.1節方法進行檢測。

1.3.2.4 HCR反應時間

采用上述優化條件，固定氯化血紅素濃度為1.5 μmol/L，氯化血紅素和G-四鏈體反應時間為60 min，設置HCR反應時間分別為30、60、90、120、150 min，采用1.3.1節方法進行檢測。

1.3.2.5 氯化血紅素濃度優化

采用上述優化條件，固定氯化血紅素和G-四鏈體反應時間為60 min，設置氯化血紅素濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 μmol/L，采用1.3.1節方法進行檢測。

1.3.2.6 氯化血紅素和G-四鏈體反應時間優化

采用上述優化條件，設置氯化血紅素和G-四鏈體反應時間分別為10、30、60、90、120 min，采用1.3.1節方法進行檢測。

1.3.3 重金屬離子對氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測的干擾測定

采用1.3.2節中優化的實驗條件，將相同濃度（1 μmol/L）的Hg2+、Ag+、Pb2+、Cd2+、Cu2+分別添加到蘇丹紅III溶液中，按照1.3.1節方法進行檢測，測定重金屬離子對該方法的干擾程度。

1.3.4 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測性能測定

1.3.4.1 靈敏度測定

在優化條件下，用pH 7.4 PBS將蘇丹紅III標準溶液稀釋系列梯度質量濃度（0、0.1、0.5、1、5、10、50、250 ng/mL），用1.3.1節方法進行檢測，觀察溶液顏色變化，在450 nm波長處測定吸光度。以蘇丹紅III質量濃度的對數為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性擬合，得到線性方程和相關系數，計算方法的檢測限（limits of detection，LOD）：

式中：σ為空白對照檢測10次的平均標準偏差；S為斜率。

1.3.4.2 特異性測定

采用1.3.1節的方法檢測相同質量濃度（100 ng/mL）的蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅IV、對位紅、日落黃標準品，同時設PBS為空白對照。觀察溶液顏色變化，在450 nm波長處測定吸光度。

1.3.4.3 實際樣品測定

參考GB/T 19681—2005《食品中蘇丹紅染料的檢測方法 高效液相色譜法》[21]對樣品進行前處理，稱取2 g辣椒醬、辣醬粉、番茄醬樣品（精確到0.001 g），分別添加高、中、低3種水平的蘇丹紅III標準溶液，使加標含量分別為5、50、200 ng/g。然后加入10 mL正己烷，振蕩混勻，超聲提取10 min，以5 000 r/min離心5 min。移取正己烷層，殘渣用正己烷重復提取1次，合并兩次上清液。氮吹儀濃縮上清液，乙腈定容至1 mL，用PBS稀釋5 倍后采用1.3.1節的方法進行檢測，計算加標回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。同時采用GB/T 19681—2005[21]對樣品進行檢測，并對兩種方法的檢測結果進行比較。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測條件優化

如圖2A所示，吸光度隨著檢測探針濃度的增加而增加，當濃度超過80 nmol/L后，吸光度無顯著變化（P＞0.05），故檢測探針最佳濃度為80 nmol/L。如圖2B所示，吸光度隨著結合時間的延長而增大，當結合時間大于30 min后，吸光度無顯著變化（P＞0.05），意味著反應基本達到飽和狀態。因此，后續實驗選擇靶標與適配體的結合時間為30 min。如圖2C所示，當H1和H2濃度均達到400 nmol/L后，吸光度無顯著變化（P＞0.05），可能是由于H1和H2濃度過大產生了空間位阻，影響了雜交鏈的進一步形成。HCR反應時間過短會影響檢測靈敏度，但時間過長則會影響檢測效率，圖2D表明，當時間超過60 min后，吸光度無顯著變化（P＞0.05），說明反應達到飽和狀態，故HCR反應時間選擇60 min。由圖2E和F可知，氯化血紅素最佳濃度為0.8 μmol/L，氯化血紅素和G-四鏈體最佳反應時間為30 min。

圖2 不同實驗條件對蘇丹紅III檢測的影響Fig. 2 Effects of different experimental conditions on the detection of Sudan III

2.2 重金屬離子對氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測的干擾分析

一些金屬離子可選擇性地與DNA雙鏈中的堿基結合，形成金屬介導的堿基對。研究證明一些金屬離子能促進或阻礙氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶的形成，進而影響DNA酶活性[22-27]。從圖3可以看出，金屬離子對溶液的吸光度無顯著影響，主要原因可能與設計的探針序列及功能不同有關，基于氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶測定重金屬離子的傳感器，大都依賴于設計富含特定堿基的功能序列識別重金屬離子來完成檢測[22-26]。比如，利用Ag+通過C-Ag+-C配位鍵促進氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶活性以實現Ag+檢測[22]。利用Hg2+與T堿基特異性結合原理，通過形成T-Hg2+-T結構抑制或促進該DNA酶活性實現Hg2+的檢測[23-25]。而本實驗所用探針（H1和H2）并不是針對重金屬離子設計的功能探針，在形成G-四鏈體結構時，無法形成錯配的雙鏈結構。所以，重金屬離子對DNA酶的活性影響不大。

圖3 重金屬離子對氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器的影響Fig. 3 Effect of heavy metal ions on the colorimetric biosensor based on hemin/G-quadruplex DNAzymes

2.3 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測性能分析

2.3.1 靈敏度分析

如圖4A所示，當蘇丹紅III質量濃度為0.5 ng/mL時，肉眼可見明顯的顏色變化，因此，該方法可視化LOD為0.5 ng/mL。由圖4B可知，吸光度隨著蘇丹紅III質量濃度的增加而增加，蘇丹紅III在0.5～250 ng/mL范圍內呈良好線性關系（R＝0.995），LOD為0.09 ng/mL。由表2可知，與GB/T 19681—2005方法[21]和文獻的蘇丹紅檢測方法相比，本研究建立的方法具有高靈敏度。

圖4 不同蘇丹紅III質量濃度下的檢測體系顏色（A）與吸光度（B）變化Fig. 4 Changes in the detection system’s color (A) and absorbance value (B) versus concentrations of Sudan III

表2 蘇丹紅檢測方法比較Table 2 Comparison of reported methods for the detection of Sudan dyes

2.3.2 特異性分析

如圖5所示，當檢測體系中含有質量濃度為100 ng/mL的蘇丹紅I～IV時，溶液在450 nm波長處的吸光度達到0.47～0.62，而對位紅和日落黃并未引起反應溶液顏色明顯變化，其吸光度與空白樣品差異不顯著（P＞0.05）。表明該適配體對蘇丹紅I～IV具有類選擇性，可能是由于蘇丹紅I～IV結構高度相似，這對檢測一類結構相似的靶標時可能更有應用意義。然而Wang Ying等[19]的特異性分析結果顯示，蘇丹紅III適配體與蘇丹紅I、II和IV沒有明顯交叉反應，具體原因有待進一步研究。

圖5 氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶比色生物傳感器檢測蘇丹紅特異性評估Fig. 5 Specificity analysis of colorimetric biosensor based on hemin/G-quadruplex DNAzymes for Sudan detection

2.3.3 實際樣品分析

如表3所示，本方法的加標回收率為84.3%～101.6%，RSD為4.13%～8.36%。本方法的加標回收率與GB/T 19681—2005法相比差異不顯著（P＞0.05），表明本方法結果準確可靠。

表3 氯化血紅素/G四鏈體DNA酶比色生物傳感器法與GB/T 19681—2005高效液相色譜法加標回收對比（n ＝3）Table 3 Comparison of spiked recoveries between colorimetric biosensor based on hemin/G-quadruplex DNAzymes and HPLC (n = 3)

3 結 論

以蘇丹紅III適配體為識別分子，以氯化血紅素/G-四鏈體DNA酶為信號探針，結合HCR信號放大策略，構建了一種簡單、新穎、高靈敏的比色生物傳感器，用于檢測食品中蘇丹紅。在優化條件下，該比色傳感器方法LOD為0.09 ng/mL，加標回收率為84.3%～101.6%，RSD為4.13%～8.36%，可特異性識別蘇丹紅I、II、III、IV，檢測結果準確可靠。與GB/T 19681—2005方法相比，本方法樣品前處理簡單、不需要大型儀器；與傳統的免疫方法相比，不需要制備抗體，檢測成本低廉，同時也可實現高通量檢測；可為批量實現食品中蘇丹紅的快速檢測提供一定技術支撐。