基于轉錄組學分析酸脅迫影響鼠傷寒沙門氏菌耐酸能力的機理

楊克慧，董鵬程，劉昀閣，張一敏,2，毛衍偉，梁榮蓉，羅 欣,2,3，朱立賢,*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.國家牛肉加工技術研發專業中心，山東 泰安 271018；3.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095）

沙門氏菌廣泛存在于牛、羊、豬、家禽、鳥類等多種動物的腸道及內臟，并通過糞便傳播，可導致人類發燒、腸胃炎、敗血癥等多種疾病，是世界范圍內引起食品公共安全問題的主要食源性致病菌之一[1]。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）是與人類沙門氏菌病相關的重要血清型，每年在全世界造成約13億 例胃腸炎、1 600萬 例傷寒和300萬 人死亡[2]。為此，食品工業已經制定了各種控制措施消減微生物，通常采用乳酸、檸檬酸、過氧乙酸等有機酸噴淋來消除肉類及蔬菜上的沙門氏菌[3-5]。但長期以及不適當的酸處理會使沙門氏菌處于一種弱酸的脅迫環境，進而誘導其產生耐酸反應（acid tolerance response，ATR）。類似地，在肉牛屠宰加工時，新鮮胴體的微生物通常來源于糞便或皮毛[6]。畜禽屠宰后胴體肌糖原降解產生乳酸、ATP分解產生磷酸根離子等會使胴體pH值下降到5.4左右，這種弱酸環境也會使沙門氏菌產生酸脅迫，進而產生ATR[7]。

ATR是指沙門氏菌經過溫和酸脅迫后，在強酸致死條件下耐受能力增強的現象。沙門氏菌存在多種與ATR相關的調節因子，包括RpoS、Fur以及雙組分信號傳導系統OmpR/EnvZ和PhoP/PhoQ等，能夠誘導酸休克蛋白的表達，進而防止或修復酸應激引起的大分子損傷[8]。此外，精氨酸代謝系統能夠通過脫羧作用消耗細胞內質子，維持穩定的胞內pH值[9]；ATP合酶系統通過質子排出產生質子遷移力，促進胞內多余質子排出，維持胞內pH值和細胞存活[10]。同時，經酸應激后鼠傷寒沙門氏菌細胞膜環丙烷脂肪酸合酶基因cfa的表達水平顯著升高，增加細胞膜環丙烷脂肪酸含量，降低細胞膜對H+通透性，進一步降低質子流入胞質的程度[11]。目前對于沙門氏菌ATR的研究多集中于酸應激后其相應機制的探討[12]，而溫和酸脅迫對鼠傷寒沙門氏菌ATR、交叉保護及毒力因子的相關影響機制尚不完全清楚。

此外，鼠傷寒沙門氏菌在強酸環境下仍可以存活并引起人類疾病，說明其具有較強的耐酸性以及在食品中形成危害的潛力。沙門氏菌產生ATR的因素有很多，除酸脅迫條件（脅迫pH值、溫度、時間等）、酸激條件和培養基成分外，血清型和菌株特性也是重要的影響因素[13]。Lianou等[14]評估了酸脅迫對不同血清型及同一血清型不同來源沙門氏菌產生的ATR，結果表明沙門氏菌ATR的產生具有菌株依賴性。深入了解酸脅迫對鼠傷寒沙門氏菌ATR的影響機制，可以揭示ATR產生的真實規律，有助于針對性地制定控制和消除ATR的策略。為此，本研究采用轉錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）技術分析酸脅迫（pH 5.4）和非酸脅迫條件下鼠傷寒沙門氏菌轉錄反應特征，并通過DEGs富集分析闡明鼠傷寒沙門氏菌與酸脅迫相關的生物學途徑，進一步明確酸脅迫對鼠傷寒沙門氏菌ATR及其他交叉保護抗性的產生機制，以期為鼠傷寒沙門氏菌在肉制品中的控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028由山東農業大學食品科學與工程學院畜產品加工實驗室保藏。

LB（Luria-Bertani）肉湯、LB瓊脂 北京陸橋技術股份有限公司；鹽酸（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）北京索萊寶科技有限公司；反轉錄試劑盒（Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR）、實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）試劑盒（SYBR?Green Premix ProTaqHS qPCR Kit II）湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

G154DWS滅菌鍋 廈門致微公司；HF safe-MJQ1型紅外線滅菌器 上海力申科學儀器有限公司；1300 SERISES A2生物安全柜 美國Thermo Scientific公司；細菌培養皿 美國康寧公司；Gene Quant微量核酸蛋白測定儀 英國Biochrom公司；PTC-200 PCR儀、CFX 96 real-time PCR檢測系統 美國Bio-Rad公司；2100生物分析儀 美國Agilent公司；5804R離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及酸脅迫處理

將保存于-80 ℃的鼠傷寒沙門氏菌接種于新鮮LB培養基中，37 ℃振蕩培養18 h活化2次。參照田牧雨等[15]的方法并稍作修改，取活化后菌液接種于pH 7.2的LB培養基（非酸脅迫對照組）及pH 5.4、5.0和4.5的LB培養基（3 mol/L鹽酸溶液調節，酸脅迫處理組）中，37 ℃振蕩培養4 h， 4 ℃、10 000×g離心10 min，去除上清液，無菌PBS洗滌菌體3次，收集菌體保存備用。

1.3.2 鼠傷寒沙門氏菌耐酸能力的測定

參照Ye Beining等[16]的方法并稍作修改，將各酸脅迫組和非酸脅迫組鼠傷寒沙門氏菌調整菌液濃度為7（lg（CFU/mL）），取1 mL菌液接種于9 mL pH 3的LB中（3 mol/L鹽酸溶液調節），37 ℃酸激2 h。取酸激0 h和2 h菌液梯度稀釋并涂布于LB平板，37 ℃倒置培養24 h后進行菌落計數，計算存活率。存活率為酸激2 h后菌落數與初始菌落數之比（%）。進行3次獨立重復實驗。

1.3.3 RNA提取、文庫構建及測序

對上述酸脅迫組（pH 5.4）和非酸脅迫組的鼠傷寒沙門氏菌進行RNA提取，通過瓊脂糖凝膠電泳和2100生物分析儀進行RNA完整性和質量檢測。RNA檢測合格后，去除rRNA，通過Oligo磁珠富集帶有polyA尾的mRNA，加入Fragmentation Buffer通過二價陽離子將所得到的mRNA隨機打斷。以片段化的mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，并進行純化。對純化后的雙鏈cDNA進行末端修復、加A尾、連接測序接頭、篩選370～420 bp左右片段、PCR擴增并純化以獲取文庫。cDNA文庫在Illumina測序平臺進行測序。

1.3.4 差異基因（differentially expressed genes，DEGs）表達分析

使用每百萬堿基對測序轉錄本序列片段每千堿基片段的預期數量（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped，FPKM）法計算組間及樣本間的相關性系數，DEGs篩選標準為|log2差異倍數（fold change，FC）|≥1且錯誤發現率（false discovery rate，FDR）＜0.05[17]。

1.3.5 GO和KEGG富集分析

以進行差異顯著分析并注釋到基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫的基因集為背景基因集，差異顯著性分析所得到的DEGs注釋到GO和KEGG數據庫的基因集為DEGs集，運用超幾何檢驗進行GO和KEGG富集分析。GO富集分析以term為單位，確定DEGs在GO中的分布。KEGG富集分析以pathway為單位，找出DEGs顯著富集的pathway，并進一步確定DEGs參與的代謝通路及所發揮的生物學作用[18]。

1.3.6 real-time PCR驗證相關DEGs

為了驗證RNA-seq實驗結果的可靠性，選取10個與耐酸相關的DEGs，根據NCBI所公布的鼠傷寒沙門氏菌的基因序列，以16S rRNA為內參基因，Oligo 6.0設計引物，基因名稱及引物序列見表1。

表1 real-time PCR基因及引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.4 數據處理與統計分析

耐酸能力實驗數據采用SPSS 21.0軟件的ANOVA法進行單因素方差分析。熒光定量基因表達結果采用Bio-Rad CFX Manager軟件進行相對定量分析，使用Microsoft Office Excel軟件對real-time PCR和RNA-seq結果進行Pearson相關性分析。實驗結果使用Origin 2018軟件繪圖。實驗結果用平均值±標準誤表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 酸脅迫對鼠傷寒沙門氏菌耐酸能力的影響

將酸脅迫和非酸脅迫鼠傷寒沙門氏菌在pH 3的強酸條件下進行酸激，其存活率如圖1所示，存活率越高，耐酸能力越強。各酸脅迫組的耐酸能力顯著高于非酸脅迫組（P＜0.05），表明鼠傷寒沙門氏菌經酸脅迫后能夠產生ATR，與Lianou[14]和田牧雨[15]等的研究結果一致。經pH 5.4和pH 5.0酸脅迫后的存活率分別為33.33%和36.68%，pH 4.5時存活率高達71.72%，顯著高于pH 5.4和pH 5.0（P＜0.05）。鮮切番茄和蘋果的pH值接近4.5[20]，反映了鮮切水果被沙門氏菌污染后其致病風險的增加，為酸性食品實際生產加工過程中沙門氏菌的防控提供理論基礎。為了在惡劣環境下存活，鼠傷寒沙門氏菌必須克服許多復雜的環境脅迫，其中酸脅迫是一個重要的影響因素[21]。不同酸脅迫pH值（5.4、5.0和4.5）處理均能夠使鼠傷寒沙門氏菌產生ATR，且生鮮牛肉的極限pH值約為5.4，因此選擇pH 5.4的酸脅迫條件開展后續RNA-seq。

圖1 酸脅迫對鼠傷寒沙門氏菌耐酸能力的影響Fig. 1 Effect of acid stress on the acid tolerance response of S. typhimurium

2.2 RNA-seq質量評估及基因組比對結果

RNA-seq數據中，將酸脅迫組及非酸脅迫組原始序列進行過濾剔除低質量數據，得到過濾后序列為原始序列的97.60%～99.00%，其錯配率低于0.03%，Q30比率在93.97%～94.88%之間，GC含量均高于53.60%（表2）。酸脅迫處理組及非脅迫對照組的測序數據準確度較高，可以進行下一步數據分析。

表2 測序數據質量評估Table 2 Quality assessment of sequencing data

2.3 DEGs可視化分析

以|log2FC|≥1且FDR＜0.05為標準篩選DEGs。酸脅迫組相對于非酸脅迫組共篩選683個DEGs，其中上調基因343個，下調基因340個（圖2），從上述結果中篩選部分耐酸相關DEGs進行后續分析。

圖2 DEGs分析火山圖Fig. 2 Volcano plot of DEGs

2.4 DEGs GO富集分析

圖3 DEGs GO富集分析Fig. 3 GO enrichment analysis of DEGs

通過Goseq將DEGs注釋到GO數據庫，得到DEGs可能具有的功能信息，其中GO包括生物過程、細胞組分和分子功能3個維度。如圖3所示，經酸脅迫后，DEGs主要富集到生物過程和分子功能。其中生物過程顯著富集到運動（GO：0040011）、對外部刺激的反應（GO：0009605）、氧化還原過程（GO：0055114）等，分別富集了19、13個和42個DEGs。分子功能中顯著富集到氧化還原酶活性（GO：0016491）、輔因子結合（GO：0048037）等，分別富集到了39個和29個DEGs。細胞組分雖無顯著富集的過程，但有較多DEGs富集到膜蛋白復合物（GO：0098796）和細胞質（GO：0005737）中。

2.5 DEGs KEGG富集分析

通過pathway顯著性富集得到DEGs參與的信號轉導途徑，圖4為DEGs KEGG富集分析散點圖。與非酸脅迫組相比，經酸脅迫后DEGs富集到與全局和總覽途徑相關的碳代謝（seo01200）、微生物在不同環境中的代謝（seo01120）和次生代謝產物的生物合成（seo01110）等過程，分別富集到28、53個和64個DEGs；與碳水化合物代謝相關的三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA）（seo00020）、磷酸戊糖途徑（seo00030）、糖酵解（seo00010）等途徑，分別富集到10、13個和8個DEGs；與細胞運動相關的細菌趨化（seo02030）和鞭毛組裝（seo02040），分別富集到14個和18個DEGs；與氨基酸代謝相關的谷胱甘肽代謝（seo00480）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝（seo00260），分別富集到9個和10個DEGs。其他氨基酸代謝如精氨酸和脯氨酸代謝（seo00330）、組氨酸代謝（seo00340）等途徑雖無顯著富集，但仍有較多DEGs表達上調。

圖4 DEGs KEGG富集分析Fig. 4 KEGG enrichment analysis of DEGs

2.6 DEGs real-time PCR驗證

結合RNA-seq結果選取10個與耐酸相關的DEGs，以16S rRNA為內參基因，對其進行real-time PCR驗證。real-time PCR測定結果與RNA-seq的基因表達趨勢一致，Pearson相關系數為0.98，驗證了RNA-seq結果的可靠性（圖5）。其中與賴氨酸代謝相關的cadA、細胞膜組成相關的ompC、鞭毛組裝相關的fliC、細菌趨化相關的cheA、交叉保護相關的katG和oxyR以及雙組分調控系統相關的pmrA表達上調，其他耐酸相關nlpD、rpoS和mgtA表達下調，表明鼠傷寒沙門氏菌耐酸能力的產生受到多個基因多條通路的調節。

圖5 real-time PCR和RNA-seq相關性分析Fig. 5 Correlational analysis between real-time PCR and RNA-seq

2.7 鼠傷寒沙門氏菌耐酸能力的影響機制

近年來，利用RNA-seq從分子水平上揭示細菌的耐酸機制已成為重要的研究方向之一。鼠傷寒沙門氏菌作為備受世界關注的食源性致病菌，經弱酸環境脅迫后，在致死酸環境下的存活率顯著升高，這可能是細菌內部抵御應激環境的防御系統表達所致。為此，本研究根據RNA-seq相關DEGs，結合KEGG pathway富集分析和GO功能注釋分別從氨基酸代謝、細胞膜組成、細菌趨化與鞭毛組裝、能量代謝、碳水化合物代謝、交叉保護和毒力基因的調控7個方面系統分析影響酸脅迫鼠傷寒沙門氏菌耐酸能力的相關機制（圖6）。

2.7.1 氨基酸代謝系統

鼠傷寒沙門氏菌經酸脅迫后賴氨酸代謝系統被激活，賴氨酸脫羧酶基因cadA和賴氨酸-尸胺轉運蛋白基因cadB表達上調，其log2FC分別為2.94和2.97（圖6）。當賴氨酸代謝系統激活后，cadA編碼賴氨酸脫羧酶使賴氨酸分解為尸胺同時消耗1個質子，cadB編碼尸胺轉運蛋白將脫羧產物運出，維持細胞穩定的pH值。Hu Shuangfang等[22]在大腸桿菌O157:H7中研究表明，cadA和cadB介導的賴氨酸脫羧作用，能夠消耗胞內多余的質子，保持胞漿穩定的pH值，從而提高菌株的耐酸能力。

圖6 鼠傷寒沙門氏菌耐酸機制Fig. 6 Acid tolerance response mechanism of S. typhimurium

此外，經酸脅迫后谷胱甘肽代謝（seo00480）相關基因的表達也出現了變化。谷胱甘肽是細胞活性氧的主要拮抗分子，有兩種存在形式，分別為氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）和還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH），GSH在谷胱甘肽-S-轉移酶和谷胱甘肽過氧化物酶作用下保護細胞使其免受氧化損傷[23]。與非酸脅迫組相比，經酸脅迫后arcA/B上調了gor（谷胱甘肽還原酶）和trxB（硫氧還蛋白還原酶）的表達，其log2FC分別為1.34和0.95（圖6）。這表明鼠傷寒沙門氏菌在酸脅迫過程中經歷了氧化損傷，并上調抗氧化相關基因修復酸脅迫造成的細胞損傷，以促進其在酸環境下的生存能力。Morales等[24]研究表明，鼠傷寒沙門氏菌ΔarcA缺失株經H2O2處理后，其gor和trxB酸環境轉錄水平較低，導致二硫鍵形成增加、蛋白質失活，抗氧化能力顯著降低，最終造成細胞死亡。同時，糖酵解和磷酸戊糖途徑能夠提供NADPH，NADPH也是維持硫氧還蛋白和還原型谷胱甘肽的關鍵因子[25]。編碼其他氨基酸代謝途徑的基因也受到差異調節，特別是脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸以及蘇氨酸，這些代謝途徑的上調也表明鼠傷寒沙門氏菌在酸脅迫過程中需要大量的營養。

2.7.2 細胞膜組成

HCl由離子的形式存在，主要通過破壞細胞膜及胞內酶對細菌造成傷害[26]。當細胞處于酸性環境中時，細胞膜的完整性和質子動力被破壞，細胞膜功能損傷，導致胞內質子過多，抑制細菌生長。此時鼠傷寒沙門氏菌外膜組分相關基因ompA、ompC、ompF、ompW和ompX顯著上調，其log2FC分別為1.86、2.45、1.17、1.15和1.42；內膜組分相關基因yaiY、sfbC、gltK以及其他膜蛋白相關基因yoaE也呈現不同程度的上調，其log2FC分別為1.60、1.31、1.42和1.43（圖6）。細胞膜損傷后，沙門氏菌上調細胞膜結構相關基因的表達，進一步增強鼠傷寒沙門氏菌的耐酸能力。其他研究也報道了酸脅迫造成細胞膜損傷，Bai Hong等[27]研究表明蘋果汁產生的酸性環境造成細胞膜損傷后編碼膜蛋白的相關基因表達上調，其耐酸能力得到增強；李琳瓊等[28]使用檸檬酸對鼠傷寒沙門氏菌進行多次酸脅迫后發現其細胞膜磷脂的相變溫度升高，細胞膜流動性降低，部分膜蛋白表達量及表達種類增加，促進菌株對酸環境的適應。

2.7.3 細菌趨化與鞭毛組裝

當鼠傷寒沙門氏菌感受到酸脅迫后，甲基化受體趨化蛋白相關基因trg、tcp、cheM、tsr、STM3216和STM3152和Aer傳感器相關基因aer表達顯著上調，其log2FC分別為2.31、2.46、1.84、1.94、1.66、1.33和2.09（圖6）。此時，趨化相關基因cheA（log2FC為1.93）識別到外界酸脅迫，將其磷酸基轉移到cheB（log2FC為2.30）或cheY（log2FC為2.22）同源反應調節因子，磷酸化的cheY將化學信號傳遞至鞭毛馬達fliM[29]，fliM（log2FC為0.89）進一步促進鞭毛動力相關的motA（log2FC為0.76）和motB（log2FC為0.72）表達[30]（圖6）。而有研究表明，當單核細胞性李斯特菌暴露于胃液的強酸環境下時，其細胞運動相關基因的表達受到抑制[31]；阪崎腸桿菌在缺乏氨基酸的M9培養基中生長時，與鞭毛形成和趨化相關的基因下調[32]。這可能是細胞運動需要消耗大量能量[33]，而當菌株暴露于極端環境中時，鞭毛形成和趨化性等代謝活動降低，用以維持菌體的其他必需代謝活動，同時也可能與菌種的不同相關。

2.7.4 能量代謝調控

為了適應惡劣的生存環境，鼠傷寒沙門氏菌的磷酸轉移酶系統（seo02060，phosphortransferase system，PTS）相關基因呈現不同程度上調。PTS系統是鼠傷寒沙門氏菌碳水化合物積累的主要機制之一，經酸脅迫后ptsI、ptsH、fruF和fruK等基因表達上調，其log2FC分別為0.66、1.10、1.49和1.27。PTS系統包含兩個胞質磷酸轉移酶（酶I和組氨酸磷酸載體蛋白）及糖特異性酶II復合物，其中ptsI編碼酶I、ptsH編碼組氨酸磷酸載體蛋白。當磷酸化的酶I將磷酸基團轉移到組氨酸磷酸載體蛋白上時，磷酸化的組氨酸磷酸載體蛋白又會將磷酸基團傳遞到細菌中的糖特異性酶II復合物中[34]。最終被轉運的碳水化合物經磷酸化轉化為糖酵解、磷酸戊糖或TCA途徑的磷酸化中間體，這也使得PTS成為高效的傳感器和快速的信號轉導系統[35-36]。而鼠傷寒沙門氏菌嘧啶代謝（seo00240）中cmk、yeiA以及nrdA等基因表達下調，其log2FC分別為-1.45、-1.00和-1.11，這可能是菌體為降低能量消耗，以維持其他必要代謝途徑的方式[37]。

呼吸電子傳遞鏈（GO：0022904）中nuoK和fdoI表達上調，其log2FC分別為1.17、0.59，呼吸鏈活性的增加使得NADH氧化生成更多的NAD+，NAD+/NADH比率的提高能夠調節細胞內質子水平[38]。同時，經酸脅迫后氧化磷酸化（seo00190）相關亞基表達上調，如琥珀酸脫氫酶亞基sdhA（log2FC為1.10）和NADH脫氫酶亞基（nuoN、nuoG、nuoF、nuoK、nuoL、nuoJ，log2FC分別為1.14、1.10、1.18、1.17、1.06和1.20），促進了ATP的合成，并消耗了NADH。編碼“物質跨膜轉運相結合”的基因表達下調，具體而言，經酸脅迫后編碼質子轉運ATP合酶的相關基因atpI、rho和atpB顯著下調，其log2FC分別為-1.75、-1.32和-1.33。當ATP合酶相關基因下調時，能夠減少質子進入菌體內部，從而在一定程度上提高鼠傷寒沙門氏菌的耐酸能力。如果ATP合酶再次將H+離子導入細胞，呼吸鏈將質子泵出胞漿的效率將在一定程度上被降低。因此，編碼ATP合酶的基因下調可以看作是呼吸鏈消耗質子，以此提高菌株對酸環境的適應[31]。

2.7.5 碳水化合物代謝

在本研究中，與非酸脅迫組相比，酸脅迫組中TCA（seo00020）的相關酶，如蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、延胡索酸酶和烏頭酸酶編碼基因mdh、icdA、fumC及acnA表達上調，其log2FC分別為1.22、0.88、1.47和1.33，促進了TCA循環的進行，并在有氧條件下產生大量ATP及NADPH。ribH（log2FC為0.99）和2-氧羧酸代謝通路（seo01210）相關基因的上調能夠促進乙酰輔酶A的消耗，降低蛋白質乙酰化水平，防止酸脅迫下細胞內pH值進一步下降[12]。TCA循環還能為某些氨基酸在內的多種化合物提供前體[39]。糖酵解（seo00010）是將葡萄糖轉化為丙酮酸并釋放出能量的過程，經酸脅迫后，參與糖酵解途徑的有8個基因顯著上調，這表明糖酵解途徑參與了鼠傷寒沙門氏菌酸脅迫的適應過程。

2.7.6 交叉保護反應調控

經酸脅迫后，鼠傷寒沙門氏菌在不同環境中的代謝（seo01120）53個DEGs表達顯著上調。當細菌在酸性環境中培養時，細胞膜、蛋白質及DNA都會受到一定程度的損傷[28]。為了減少損傷，鼠傷寒沙門氏菌會增加修復和防御相關基因的表達（圖6），如DNA復制和修復相關基因recA（log2FC為1.02），保護大分子使其免受損傷。與耐熱相關的基因danK、htrA（log2FC分別為1.34和1.02）也表現出一定程度的上調，dnaK參與蛋白質的復性或分解，并且通過減少錯誤折疊蛋白質的聚集和促進蛋白質水解防止包涵體的形成[40]。另外Spiess等[41]報道htrA能降低腸炎沙門氏菌面臨高溫環境時細胞質中錯誤折疊蛋白的積累及蛋白質損傷。因此，鼠傷寒沙門氏菌經酸脅迫后，與高溫抗性相關基因的上調為其耐熱性的提高提供了理論支持[42]。oxyR（log2FC為1.06）可以感受氧化脅迫并參與過氧化物代謝和氧化脅迫防御相關基因（katG和sodA其log2FC分別為2.24和0.98）的調控，katG負責編碼過氧化氫酶，對鼠傷寒沙門氏菌在強氧化環境下的存活至關重要。

2.7.7 對毒力基因的影響

外膜蛋白作為一種結構性毒力因子，其相關基因（詳見2.7.2節）表達量的增加會使細菌的毒力增強，侵入巨噬細胞的沙門氏菌還會形成包含小泡（Salmonellacontaining vacuole，SCV），借助SPI-2產生效應蛋白，阻止SCV與溶酶體融合，以此逃避吞噬作用的殺傷[43]。Chowdhury等[44]研究表明，ompA缺失的鼠傷寒沙門氏菌在小鼠巨噬細胞感染后期激活了宿主巨噬細胞的自噬，其毒力比野生株明顯降低。鞭毛合成因子（fliC、flgL、flgK、fliK、fliY和fliM，其log2FC分別為2.07、2.11、1.93、2.07、1.49和0.89）表達上調除了增強運動與趨化能力外，其毒力及黏附入侵能力也顯著提高，以幫助鼠傷寒沙門氏菌定植于食物表面或入侵宿主細胞，增加對不利環境的抵抗能力。Choi等[45]研究表明，阪崎腸桿菌的mcp突變體對小鼠上皮細胞的侵襲和黏附能力減弱，在小鼠體內的毒力減弱。

PmrA/PmrB組分系統是鼠傷寒沙門氏菌重要的雙組分調控系統，pmrA（log2FC為0.96）表達上調不僅參與酸環境的適應，還能夠調控沙門氏菌的毒力，對脂多糖的修飾有重要作用。脂多糖位于細胞膜外膜的最表面，主要由類脂A、核心多糖和側鏈多糖（O抗原）組成，在細菌定植、入侵宿主細胞以及抵御巨噬細胞吞噬作用時起到重要的自我保護作用[46]。Hua Jingjing等[47]研究表明，阪崎克羅諾腸桿菌pmrA過表達促進了類脂A的磷酸乙醇胺修飾。在低pH值條件下生長時，磷酸乙醇胺與類脂A結合可以增加對cAMP的抵抗力，并降低宿主固有免疫系統的識別力和殺傷力[48]。與O抗原生物合成酶相關的rfb基因簇（rfbB、rfbD、rfbH、rfbU和rfbI，其log2FC分別為-1.61、-1.24、-1.11、-0.90和-0.87）和rfa基因簇（rfaI、rfaG和rfaJ，其log2FC分別為-1.37、-1.77和-1.05）相關基因的表達一定程度上下調。而Bai Hong等[49]研究表明，酸應激后腸炎沙門氏菌與毒力相關的rfa、rfb和rfc基因簇相關基因表達上調，與本研究結果相反，這可能與不同血清型的菌株相關，其結果仍有待進一步研究。

鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白和鞭毛相關基因表達上調，促進了菌株的運動、趨化和細胞膜的穩定性并增強了毒力，其在酸脅迫下毒力基因高表達的趨勢，揭示了人們攝入被沙門氏菌污染的含酸食品會增加其致病性風險。

3 結 論

利用RNA-seq技術分析了鼠傷寒沙門氏菌酸脅迫后的基因表達變化。在這683個DEGs中，其中上調基因343個，下調基因340個。酸性環境使得鼠傷寒沙門氏菌胞質內質子過多，為了平衡多余的質子，細胞內NAD+/NADH的比值升高，TCA促進乙酰輔酶A的消耗降低蛋白質乙酰化水平，同時降低ATP合酶的活性。鼠傷寒沙門氏菌的運動能力增強，一些功能基因包括應激反應調控蛋白、膜轉運蛋白的上調以修復酸脅迫帶來的損傷，促進細胞存活。碳水化合物代謝和PTS等產能系統上調，一些消耗能量的代謝過程下調，以維持細胞膜損傷、DNA損傷修復等必要過程提高鼠傷寒沙門氏菌的耐酸能力。最后，與毒力相關的鞭毛、外膜蛋白以及雙組分系統等相關基因的表達上調揭示了鼠傷寒沙門氏菌在酸性環境下致病風險的增加。