基于乳酸菌生物轉化消除酵母抽提物酵母味能力評價

馬春蕾，汪繼偉，魏楊建，陳 雄，李 沛，李 庫，熊 建，李 欣,*

（1.發酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業微生物重點實驗室，湖北省工業發酵協同創新中心，湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068；2.安琪酵母股份有限公司，酵母功能湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443000）

酵母抽提物是一種采用現代生物技術將酵母中的蛋白質、核酸等大分子降解為核苷酸、肽、氨基酸等小分子物質后精制而成的一種天然酵母制品[1-2]。酵母抽提物中含有糖類、維生素、有機酸、肽、核苷酸等，是天然的營養鮮味和增味劑，被廣泛用作調味劑[3-4]。其中，酵母抽提物呈現豐富的風味物質，如酮、醛、酸、醇、呋喃、吡嗪、噻唑和萜烯類等芳香活性化合物[5-8]。然而，存在于酵母抽提物中的酵母味并未被廣泛接受。眾多研究表明酵母抽提物中的酵母味主要由揮發性風味化合物導致，如甲酚、吲哚[9]、乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、正辛醛、苯乙烯、鄰二甲苯、糠醇[10]、3-甲基吡啶[11]等。酵母味的存在一定程度影響了酵母抽提物應用的廣泛性。目前，除了對工藝流程進行適當的調整和優化（熱處理、高壓均質、氨基酸和銨鹽添加等[12-15]）以達到減弱酵母味形成外，去除或掩蓋酵母味的研究鮮有報道，且上述方法具有能耗大、去除酵母味的同時未改善酵母抽提物風味等不足之處。因此開發新型去除或掩蓋酵母味的技術具有重要意義。

乳酸菌作為一類益生菌被廣泛應用于生產各種發酵食品，通過激活一些次級代謝途徑，形成風味化合物和典型結構，提升產品的風味和質地，減輕其中不良風味[16]。不同種類乳酸菌的風味代謝不同，從而導致不同乳酸菌作為發酵劑制成的產品具有差異性，如植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）主要存在于乳制品中，乳酸鏈球菌（Streptococcus lactis）與乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）多存在于奶酪[17]。同時，菌種差異和發酵方式的不同也能影響發酵食品的風味[18]。混菌發酵不僅能豐富發酵食品的風味[19]，還能防止產品異味和酸敗的形成[20]。除此之外，不同種類乳酸菌混菌發酵體系下，復雜的微生物菌群相互促進混合微生物中所含單一乳酸菌的特定風味化合物代謝的同時[21]，也能獲得具有創新成分的潛在食品發酵劑[22]，改善發酵產品品質。目前，乳酸菌發酵去除酵母抽提物酵母味的研究鮮有報道。可見，在微生物發酵去除酵母抽提物酵母味的研究中，乳酸菌是一類值得高度關注的微生物。

本研究基于3種乳酸菌為發酵劑，單菌或混菌發酵酵母抽提物，通過比較分析發酵后酵母抽提物的風味、呈味和氨基酸等指標，探索不同發酵體系對酵母抽提物酵母味去除和品質改善的效果和差異性，旨在為后期研發新型酵母抽提物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母抽提物FG10由安琪酵母股份有限公司提供。乳酸鏈球菌、植物乳桿菌ATCC8014和乳酸乳球菌CICC6242分別來自實驗室保藏、北京生物保藏中心和中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與設備

HNY-211B恒溫培養振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；CJ-2D型無菌操作臺 天津市泰斯特儀器有限公司；SPX-150D型恒溫生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；Ultimate 3000高效液相色譜儀美國賽默飛世爾科技公司；7890B氣相色譜儀 美國安捷倫公司；SBA-90生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所；Milli-Q Plus超純水系統 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1種子活化

取于-80 ℃冰箱中保存的菌種甘油管1 mL接種于裝有50 mL/250 mL的液體種子培養基（De Man Rogosa Sharpe培養基）中，37 ℃培養箱中靜置培養24 h后，再將培養后的菌液接種于新的液體種子培養基中，于37 ℃培養箱中靜置培養24 h進行二級活化，得到種子液。

1.3.2 發酵培養基及發酵方法

發酵培養基為酵母抽提物（FG10）50 g/L、蔗糖30 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、七水硫酸鎂0.2 g/L。用0.1 mol/L NaOH溶液調節pH 7.0后115 ℃高壓滅菌20 min。

7種發酵體系分別為：乳酸乳球菌單菌發酵（R）；乳酸鏈球菌單菌發酵（L）；植物乳桿菌單菌發酵（Z）；乳酸乳球菌和乳酸鏈球菌兩菌發酵（R+L）；乳酸乳球菌和植物乳桿菌兩菌發酵（R+Z）；乳酸鏈球菌和植物乳桿菌兩菌發酵（L+Z）；乳酸乳球菌、乳酸鏈球菌和植物乳桿菌三菌發酵（R+L+Z）。

兩菌發酵或三菌發酵均遵循同步接種，且接種比例為1∶1或1∶1∶1。所有發酵過程均在相同的參數下完成，包括發酵溫度30 ℃、發酵轉速200 r/min、裝液量50 mL/250 mL、發酵周期24 h，取樣點6、12、24 h。接種量控制二級活化種子總菌液OD600nm值在0.2左右后接種于無菌發酵培養基中。

1.3.3 風味物質的測定

樣品處理方法：取5 mL樣品，加1.5 g氯化鈉，再加1 μL內標鄰二氯苯（0.1 μL/mL）于50 ℃磁力攪拌器上加熱平衡30 min后，將萃取頭插入樣品瓶頂空部分，50 ℃萃取30 min。將萃取頭插入氣相色譜儀進樣口，進樣口溫度250 ℃解吸5 min后進行氣相色譜分析[23]。

色譜條件：色譜柱為安捷倫INNOWAX柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），起始溫度40 ℃，保持5 min；以5 ℃/min升溫到240 ℃，保持8 min。汽化室溫度為250 ℃，載氣為氮氣，柱前壓為20.704 psi，恒定流量為6.5 mL/min；不分流進樣，溶劑延遲時間為1.5 min[10]。

1.3.4 呈味物質的測定

乳酸和谷氨酸均用生物傳感儀測定；核苷酸的測定參考GB/T 23530—2009《酵母抽提物》。

1.3.5 氨基酸的測定

將12 000×g離心5 min后的樣品（500 μL）用氯甲酸乙酯衍生化后[24]，用氣相色譜（火焰離子化檢測器和色譜柱DB-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm））進行氨基酸濃度的測定。柱溫設定為70 ℃保留5 min，然后以5 ℃/min上升到280 ℃，保留5 min；進樣口溫度設定為280 ℃，檢測器溫度設定為300 ℃；載氣為氮氣。

1.3.6 感官評定

感官評定由來自湖北工業大學的12 名感官評價員（6 男6 女，年齡20～40 歲）完成。參考ISO 8586：2012，在感官室（室溫（25±2）℃）中被挑選和訓練，并且都有一年以上對酵母抽提物的感官評價經驗。描述酵母抽提物特性的術語由評價員在評估一些樣品和參照資料后共同提供[11,25]，風味評分主要基于4個項目：酵母味、醬香味、酸味和異味。參考GB 10221—2021《感官分析 術語》建立評分標準，評估員使用10分制（0～3，弱；4～6，中等；7～10，強）通用強度量表表征嗅評強烈程度。樣品（樣品供應溫度（37±2）℃）由小組成員一式三份進行嗅評打分，然后取平均值作為風味評價的結果。

1.4 數據分析

所有實驗均進行3次重復平行實驗。主成分分析（principal component analysis，PCA）和顯著性分析（P＜0.05，差異顯著）使用IBM SPSS Statistics 23.0軟件。氣相色譜檢測物和高液相色譜檢測物分別采用內標法和外標法進行定量，根據標準品出峰時間確定相對保留時間進行定性。圖像制作使用Origin軟件。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌在酵母抽提物中的生長分析

如圖1所示，3種乳酸菌在發酵培養基中均能生長，且具有差異性。乳酸乳球菌（R）在酵母抽提物中生長最佳，發酵12 h后達到生長穩定期，OD值穩定在9.79左右。植物乳桿菌（Z）在整個發酵周期處于持續生長狀態，生長速率略低于乳酸乳球菌，27 h生物量與乳酸乳球菌（R）達到一致水平。乳酸鏈球菌（L）在酵母抽提物發酵培養基中生長活性最低，發酵24 h生物量穩定在OD600nm值為8.34左右。

圖1 乳酸菌在基于酵母抽提物的發酵培養基中的生物量變化Fig. 1 Biomass changes of lactic acid bacteria cultured in fermentation medium based on yeast extract

上述3種乳酸菌在基于酵母抽提物為主要營養的發酵培養基下均能生長，且乳酸乳球菌（R）和乳酸鏈球菌（L）在24 h后均達到生長穩定期，因此3種乳酸菌均能在改善酵母抽提物實驗中做進一步研究，且發酵周期確定為24 h。

2.2 不同發酵體系下酵母抽提物風味分析

圖2 酵母抽提物在不同發酵體系下風味物質熱圖分布Fig. 2 Heat map of flavor substances in yeast extract in different fermentation systems

如圖2所示，FG10型號酵母抽提物通過氣相檢測表明包含的酵母味主體物質有丙酸和異戊酸。與發酵前相比，在乳酸乳球菌和乳酸鏈球菌混合發酵（R+L）、乳酸乳球菌和植物乳桿菌混合發酵（R+Z）和三菌混合發酵（R+L+Z）體系下，發酵結束后酵母抽提物的風味物質總含量略微降低，下降2 ng/mL左右。剩余4種發酵體系下酵母抽提物發酵終點的風味物質總含量均上升，其中乳酸鏈球菌單菌發酵后風味物質總含量增加最高，增加了387.63 ng/mL。乳酸鏈球菌和植物乳桿菌混合（L+Z）發酵后，風味物質總含量增加量也較高，增加了148.12 ng/mL。酵母抽提物中具有腐敗臭味的丙酸在7種發酵體系下均被明顯消除，L+Z體系下，發酵6 h后丙酸才完全去除。在3種乳酸菌單菌、2種兩菌混合（R+Z、L+Z）和R+L+Z發酵后，酵母抽提物中具有酸臭味的異戊酸均有增加，2種兩菌混合（R+Z、L+Z）和R+L+Z發酵后增加量最多，分別增加了19.79、22.58 ng/mL和22.32 ng/mL。只有兩菌混合發酵（R+L）體系能大幅減少酵母抽提物中異戊酸的含量，與發酵前相比降低了86.73%。

除兩菌混合（R+Z）和R+L+Z發酵外，酵母抽提物中具有花香、果香的醇類物質2,3-丁二醇、異戊醇和苯乙醇均有部分或全部增加。其中，乳酸鏈球菌發酵后醇類物質增加最明顯，達253.63 ng/mL，占總風味物質的61.09%；而L+Z發酵后，醇類物質中僅單一的異戊醇增加明顯，增加了82.54 ng/mL。酵母抽提物中特征香味吡嗪類物質在植物乳桿菌單菌、2種兩菌（R+Z、L+Z）和R+L+Z發酵下被完全消耗，而在另外3種發酵體系下均有略微增加，表明植物乳桿菌在單菌和混菌體系下均有利用吡嗪類物質的能力。除了R+L+Z體系外，剩余6種發酵體系均能產生具有奶香味的乙偶姻。乳酸鏈球菌發酵后乙偶姻增加量最多，達142.20 ng/mL，L+Z發酵后乙偶姻生成量也較高，為57.49 ng/mL。3種兩菌發酵（R+L、R+Z、L+Z）體系下，酵母抽提物中具有杏仁香氣的苯甲醛被消耗完全。

隨后對酵母抽提物揮發性風味物質進行PCA，結果如圖3所示，由此產生的PCA前2個PC占總方差的77.48%，其中PC1占47.97%。7種發酵體系下酵母抽提物中的風味物質均處于不同象限和不同位置，說明7種發酵體系下酵母抽提物中揮發性風味物質具有明顯差異。

圖3 酵母抽提物在不同發酵體系下風味PCAFig. 3 PCA plot of flavor components of yeast extract in different fermentation systems

乳酸鏈球菌單菌發酵后，醇類物質和乙偶姻增加明顯，且乳酸鏈球菌和植物乳桿菌混菌發酵后，異戊醇和乙偶姻也增加明顯。植物乳桿菌在單菌和混菌條件下均有消耗利用吡嗪類風味物質，可能導致酵母抽提物中典型風味物質被消耗。可見，兩菌混合（R+L）發酵后，整體風味物質含量降低，刺激性酵母味（丙酸、異戊酸）明顯去除。同時具有花香、果香和奶油香等風味化合物均有提高，其中具有果香和花香的醇類物質從0.77 ng/mL增加至10.73 ng/mL，使得酵母抽提物的整體風味呈現效果較好。值得注意的是，以上風味化合物（除丙酸和異戊酸外）均與醬香典型體基酒風味的重要骨架成分一致[26-27]。

2.3 不同發酵體系下酵母抽提物感官評定

對在7種發酵體系下發酵24 h的酵母抽提物進行了感官評定，結果如圖4所示。

圖4 酵母抽提物在不同發酵體系下發酵24 h的感官評定Fig. 4 Sensory evaluation of yeast extract fermented for 24 h with different cultures

如圖4所示，7種發酵體系下，酵母抽提物中的酵母味24 h發酵后均去除，且有新風味產生，但整體的感官評定有差異。其中，酵母抽提物經乳酸乳球菌單菌發酵后產生異味，而經乳酸鏈球菌或植物乳桿菌單菌發酵后，酵母抽提物中酵母味去除的同時均有弱酸味。兩菌發酵體系下，R+L發酵后，酵母抽提物的風味具有明顯提升，無酵母味、無異味、產酸且伴隨濃郁的發酵醬香味；R+Z發酵后，酵母抽提物的風味略微提升，有微弱的酸味和醬香味；L+Z發酵后，刺激性酸味明顯。R+L+Z發酵后，酵母抽提物風味有提升，無酵母味、無異味，且形成較高的發酵醬香味。然而，與兩菌發酵（R+L）相比，R+L+Z發酵后，酵母抽提物無酸味產生，無法達到促進酵母抽提物整體風味協調性的效果。綜上，7種發酵體系下兩菌發酵（R+L）后風味最佳，利于發酵調味品的研制。

基于上述7種發酵體系下酵母抽提物的風味和感官評定可知，酵母抽提物經R+L后，達到去除酵母味目的的同時還有形成醬香風味的效果。因此，對乳酸乳球菌和乳酸鏈球菌單菌和兩菌發酵下的酵母抽提物進行深入分析比較。

2.4 乳酸乳球菌與乳酸鏈球菌在單菌和混菌發酵體系下酵母抽提物中風味前體氨基酸分析

芳香族氨基酸及支鏈氨基酸是乳酸菌主要的風味物質形成前體氨基酸[28]，其中苯丙氨酸通過轉氨、脫羧和脫氫生成玫瑰香味的苯乙醇，支鏈氨基酸亮氨酸可通過氨基酸代謝產具有水果香味的異戊醇[15,29]。

圖5 酵母抽提物在乳酸乳球菌與乳酸鏈球菌單菌和混菌體系下風味前體氨基酸的變化Fig. 5 Changes of flavor precursor amino acids in yeast extracts fermented with single and mixed cultures of L. lactis and S. lactis

如圖5a所示，乳酸乳球菌與乳酸鏈球菌單菌和混菌發酵體系下，亮氨酸的變化呈現差異性。乳酸乳球菌單菌發酵6 h后，亮氨酸含量基本保持穩定，相比發酵前降低了202.97 mg/L，而異戊醇未檢測到。乳酸鏈球菌單菌發酵后，亮氨酸呈現先降后增的變化，發酵12 h后亮氨酸含量具有小幅度回升，然而發酵結束后亮氨酸質量濃度仍比發酵前降低了88.48 mg/L，異戊醇生成量最高為179.38 ng/mL。兩菌發酵（R+L）后，亮氨酸呈現先降后升再降的波動性變化，發酵6 h的亮氨酸質量濃度最低，降低了251.64 mg/L；發酵12 h亮氨酸質量濃度達到最高為368.05 mg/L，高于發酵前含量；發酵結束后，亮氨酸質量濃度降低至105.09 mg/L，相比于發酵前降低了176.71 mg/L，同時對應的異戊醇生成了2.83 ng/mL。

如圖5b所示，3種發酵體系下酵母抽提物中的苯丙氨酸均有增加。乳酸鏈球菌單菌發酵后，苯丙氨酸在發酵6 h質量濃度最高為139.09 mg/L，6 h后持續降低至68.84 mg/L，而發酵結束時相應苯乙醇的積累量為71.98 ng/mL。剩余2種發酵體系下，苯丙氨酸在整個發酵過程中持續增加。乳酸乳球菌單菌發酵后，苯丙氨酸的生成量最高，為194.75 mg/L，而苯乙醇未生成。R+L發酵后，苯丙氨酸的積累量為142.45 mg/L，對應的苯乙醇有1.31 ng/mL的生成量。

乳酸鏈球菌單菌發酵后，異戊醇和苯乙醇的生成量最高，而呈苦味的亮氨酸積累最高，呈鮮味的苯丙氨酸積累量較低。兩菌發酵后酵母抽提物風味前體氨基酸積累的同時（苯丙氨酸大幅提升），相應的風味化合物也相應增加，結合感官評價結果，乳酸乳球菌和乳酸鏈球菌混酵使得無酵母味的酵母抽提物中的氨基酸與風味代謝物處于較佳的平衡狀態，利于改善酵母抽提物的整體風味。

2.5 乳酸乳球菌與乳酸鏈球菌單菌和混菌發酵體系下酵母抽提物中呈味物質分析

呈味是評價酵母抽提物作為調味劑的重要指標，因此，選用乳酸、谷氨酸和核苷酸（肌苷酸+鳥苷酸）3個指標對酵母抽提物在乳酸乳球菌與乳酸鏈球菌單菌和混菌體系下呈味變化進行分析，結果如圖6所示。

圖6 酵母抽提物在乳酸乳球菌與乳酸鏈球菌單菌或混菌體系下呈味變化Fig. 6 Taste change of yeast extract fermented with single and mixed cultures of L. lactis and S. lactis

乳酸是乳酸菌主要的有機酸產物之一，具有爽口口感，使發酵調味品的咸味更加柔和[28]。如圖6a所示，隨著發酵時間的延長，乳酸含量持續增多。不同發酵體系下乳酸生成量不同。其中乳酸鏈球菌單菌發酵后的乳酸生成量最低，為3.28 g/L。乳酸乳球菌單菌發酵后的生成量為6.30 g/L。與單菌發酵相比，兩菌發酵（R+L）后酵母抽提物中的乳酸含量最高，發酵結束后達10.60 g/L，說明混合發酵更利于乳酸的積累，豐富了發酵后酵母抽提物的風味和呈味。

谷氨酸是一類重要的鮮味氨基酸，是鮮味增強劑的重要來源[30-31]。如圖6b所示，在乳酸乳球菌和乳酸鏈球菌單菌或混菌發酵體系下，酵母抽提物中的谷氨酸含量均被部分利用。乳酸乳球菌單菌發酵后谷氨酸降低了52.68%。乳酸鏈球菌在單菌發酵過程中對谷氨酸的需求低于乳酸乳球菌單菌發酵，在該發酵體系下谷氨酸降低了42.28%。在乳酸乳球菌的基礎上，兩菌發酵（R+L）后，發酵體系對谷氨酸的需求降低，發酵結束后，谷氨酸的消耗量略微降低，消耗了41.46%。

肌苷酸和鳥苷酸是核苷酸中主要呈鮮味物質，是影響酵母抽提物整體呈味的重要因素之一[32]。2種乳酸菌單菌發酵6 h后，酵母抽提物的核苷酸具有明顯差異，乳酸乳球菌單菌發酵后核苷酸含量降低了47.32%；乳酸鏈球菌單菌發酵后核苷酸質量濃度明顯提升，增加了53.01%。乳酸乳球菌與乳酸鏈球菌混酵體系中，發酵前6 h內核苷酸基本沒變，而發酵6 h后與乳酸乳球菌單菌發酵呈相同的變化趨勢，均為先升后降的波動性變化。與發酵前相比，乳酸鏈球菌單菌發酵結束后，核苷酸降低了0.02 g/L；乳酸乳球菌單菌發酵結束后核苷酸含量不變；R+L發酵后，核苷酸質量濃度增加了0.02 g/L（圖6c）。

3種發酵體系下，乳酸、谷氨酸和核苷酸（肌苷酸+鳥苷酸）的變化具有差別，R+L發酵后乳酸產量最高；谷氨酸在乳酸乳球菌和乳酸鏈球菌單菌和混菌發酵體系下均降低，其中乳酸乳球菌單菌發酵后谷氨酸含量降低最明顯，降低了52.68%；核苷酸含量呈現波動性變化，其中兩菌（R+L）發酵結束后核苷酸含量增加了0.02 g/L。可見，與單菌發酵相比，R+L發酵后，呈味呈現最佳水平狀態。

3 結 論

以酵母抽提物為主要營養組分，探索了3種乳酸菌對酵母抽提物酵母味消除和風味改善的效果。結果表明，經過乳酸菌發酵酵母抽提物的風味具有明顯變化，具有酵母味的丙酸和異戊酸被去除，具有花香、果香的風味物質提高。可見，乳酸菌是一類有效消除酵母味的微生物。然而，不同發酵體系下風味化合物變化具有差異，導致整體風味不同，如乳酸鏈球菌增加苯乙醇、異戊醇的能力明顯。值得注意的是，單純增加風味物質可能導致發酵后期整體風味不協調。酵母抽提物經乳酸乳球菌和乳酸鏈球菌混合發酵后，酵母味明顯去除，良好風味含量均有一定提高，乳酸大幅提升，呈味物質核苷酸少量增加，呈鮮味的風味前體氨基酸具有一定提高，導致整體風味和呈味呈現最佳狀態。