鉀鹽替代和附屬發酵劑對切達干酪品質的影響

余鵬飛，馬春麗，韓秀娥，王家栩，賈麗麗

（東北農業大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

在干酪制作中，NaCl起著至關重要的作用，如改善口感和質地、促進凝乳的脫水和抑制腐敗微生物的生長[1]。然而，過量食用NaCl會促進健康損害，如血壓升高和心血管疾病風險增加[2]。由于KCl具有與NaCl相似的化學性質[3-5]，因此利用KCl鹽代替NaCl降低干酪中的鈉含量已進行廣泛研究[6-7]。

與發酵劑乳酸菌相比，在干酪中添加附屬發酵劑具有改善干酪品質和促進其成熟的作用，比如增加干酪的蛋白水解以及降低苦味肽改善口感[8-10]。在益生方面，發現以瑞士乳桿菌作為附屬發酵劑可以明顯提高干酪的血管緊張素轉換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制性[11]，這些都表明附屬發酵劑可以把干酪當作優良載體，提升干酪相關的品質和賦予其健康功能。副干酪乳桿菌在食物中的益生功能被廣泛的研究，能夠降低血壓和提高ACE抑制率[12]，但作為附屬發酵劑對干酪成熟過程特性變化研究尚少。

本實驗選取實驗室保藏的在脫脂乳中表現較高的ACE抑制率的Lactobacillus paracaseiM3作為附屬發酵劑，正常鹽干酪為空白組，以在正常鹽添加附屬發酵劑、部分鉀鹽替代鈉鹽和在部分鉀鹽替代鈉鹽添加附屬發酵劑為實驗組，研究部分鉀鹽替代鈉鹽和添加附屬發酵劑L. paracaseiM3對切達干酪品質和ACE抑制活性的影響，為開發具有降壓功能的干酪提供相關理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳（新鮮無抗乳） 哈爾濱市香坊農場；副干酪乳桿菌（L. pacasei）M3 實驗室保藏菌株；商業發酵劑R-704（由Lactococcus lactissubsp.lactis和Lactococcus lactissubsp.cremoris組成）、凝乳酶Stamix 1150 北京科漢森公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）、ACE 美國Sigma公司；MRS培養基、營養瓊脂培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司；茚三酮 上海山浦化工有限公司；甘氨酸 上海慧世生化試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

K9840自動凱氏定氮儀 山東海能科學儀器有限公司；SYQDSX-280B 手提式蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；ULTRA-TURRAX T8均質機 德國IKA公司；SA402B電子舌 日本Insent司；Pilot10-15M制備型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；HYCV-30小型干酪槽 黑龍江赫益乳液科技有限公司；XF-3A型水分活度儀 廈門雄發儀器儀表有限公司；TA.XT plus型質構儀 英國Stable-Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化與培養

將L. paracaseiM3凍存菌種接種于MRS液體培養基中，37 ℃培養12 h，連續傳代活化后，再按體積分數4%接種量接種于質量分數12%的脫脂乳培養基中37 ℃培養，待其凝乳，備用。

1.3.2 切達干酪的制作

參照Hannon等[13]的干酪制作方法。干酪實驗分組為：A組，加入100% NaCl；B組，加入50% NaCl-50% KCl；C組，加入100% NaCl和0.5%L. paracaseiM3（V/V）；D組，加入50% NaCl-50% KCl和0.5%L. paracaseiM3（V/V），每組干酪添加質量分數1.7%鹽和質量分數0.01%商品發酵劑R-704。干酪放于4 ℃成熟6個月。

1.3.3 干酪理化性質的測定

取成熟6個月的切達干酪測定其組成成分。水分含量測定：采用直接干燥法參考GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；蛋白質含量測定：采用凱氏定氮法，參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》；脂肪含量測定：采用索氏抽提法，參考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》；水分活度測定：參考GB 5009.238—2016《食品水分活度的測定》；灰分含量測定：參考GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》。pH值測定：將干酪與去離子水按1∶9（m/m）的比例混合并均質，用pH值計測定。

1.3.4 干酪活菌數的測定

對干酪成熟期第0、1、2、3、4、5、6個月進行微生物的檢測，具體方法如下：取1 g干酪樣品無菌條件下研磨并和9 mL 2%的檸檬酸鈉混合均質，并用滅菌的0.1%的蛋白胨進行梯度稀釋，吸取0.1 mL涂布于固體營養瓊脂，（35±1）℃培養48 h進行細菌總數的計數[14]；再吸取0.1 mL涂布于MRS瓊脂培養基，37 ℃培養48 h進行乳酸菌的計數。

1.3.5 pH 4.6可溶性氮含量的測定

根據Fenelon等[15]的方式并作適當修改，對干酪成熟期每個月進行取樣分析。稱取5 g干酪研磨并加入20 mL pH 4.6的乙酸鈉溶液進行均質，40 ℃水浴1 h，4 ℃、8 000 r/min離心15 min，將上清液轉移至消化瓶，自動凱氏定氮測定，用所占干酪總氮量的百分比表示。

1.3.6 干酪水溶性提取物的制備

取成熟期每個月干酪20 g加入適當的去離子水，并在40 ℃水浴鍋加熱0.5 h，使用均質機均質3～4 min，除去上層脂肪，離心（4 ℃、8 000 r/min、20 min），上清液進行過濾，所得濾液進行冷凍干燥后貯存于-20 ℃冰箱。

1.3.7 干酪總游離氨基酸的測定

對干酪成熟期每個月取樣1次進行測定。采取鎘-茚三酮法[16]測定，將上述1 mL干酪水溶性提取物的上清液用100 mL容量瓶定容，取0.40 mL稀釋液、1.60 mL蒸餾水、1.00 mL茚三酮顯色劑，振蕩搖勻，保持15 min的沸水浴，同時作空白實驗，于570 nm波長處測定吸光度。利用甘氨酸標準曲線計算蛋白水解能力。

1.3.8 干酪ACE抑制活性測定

根據舒國偉[17]的方法并稍加修改，將凍干樣品配制成20 mg/mL，用0.05 mmol/L硼酸鹽緩沖液配制成5 mmol/L HHL和0.1 U/mL酶活的ACE，冷藏備用。具體方法如下：取200 μL HHL、100 μL樣品溶液分別裝入5 mL離心管混合振蕩，在37 ℃水浴3 min，再加入20 μL ACE酶液，再水浴30 min，添加200 mL 1mol/L鹽酸終止反應，最后加入1.7 mL乙酸乙酯，離心（4 ℃，4 000 r/min，10 min），吸取上層的乙酸乙酯層1 mL。旋轉蒸發后再加入3 mL去離子水，振蕩10 s，使用紫外分光光度計在波長228 nm處測定吸光度，按下式計算：

式中：Aa為包含干酪樣品的吸光度；Ab為未加入干酪樣品的吸光度；Ac為酶失活的吸光度。

1.3.9 干酪質構的測定

對干酪成熟期每個月取樣1次進行測定。根據屈倩[18]的方法并稍加修飾。用TA.XT plus型質構儀測干酪各成熟期質構，具體如下：將干酪樣品切成（2.00±0.10）cm的立方體，并在室溫下放置40 min，測試前探頭下降速率2 mm/s，測試速率1 mm/s，測試后探頭回程速率2 mm/s，下壓距離10 mm，兩次下壓間隔時間5 s，觸發壓5 g，探頭型號P/0.5，每組干酪平行測定3次。

1.3.10 干酪電子舌的測定

根據Lipkowitz等[19]的方法并稍加修飾，取成熟第6個月的干酪進行電子舌測定。取5 g干酪加入100 mL去離子均質3～4 min，除去脂肪，4 ℃、5 000 r/min離心20 min，取上清液并用0.45 μm的濾膜過濾，置于專屬燒杯，待測。

1.3.11 干酪感官評價

干酪成熟6個月的樣品進行感官評價。根據Amalshori等[20]的方法并略加修飾，選擇10 名專業成員（5 位男生和5 位女生）進行干酪感官評價，采取10 分評價表代表接受程度。主要針對色澤、苦味、質地、裂縫、咸味五方面進行打分，根據整體接受程度分為4個等級，1～3 分為差，4～5 分為一般，6～8 分為好，9～10 分為較好。每個成員品嘗干酪樣品都需要事先漱口，隨機將干酪樣品分配給成員進行獨立打分。

1.4 數據處理

每組樣品重復3次平行，用SPSS 22.0進行分析，結果以表示，P＜0.05，差異顯著，用GraphPad 2018軟件進行作圖，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）進行電子舌分析。

2 結果與分析

2.1 干酪主要成分分析

表1 切達干酪組成成分分析Table 1 Analysis of chemical composition in Cheddar cheese

鉀鹽替代50%鈉鹽和L. paracaseiM3的添加對干酪的水分、脂肪、蛋白質、水分活度均無顯著影響（P＞0.05）（表1），主要是KCl與NaCl在物理化學性質方面有著較為相似的結構[21]。部分鉀鹽替代的干酪B、D在灰分低于沒有添加鉀鹽的干酪A、C，一般而言，灰分含量主要受干酪中的鹽和礦物質比例的影響[22]，說明KCl比起NaCl更容易使得干酪鹽和礦物質比例下降，導致灰分降低。

2.2 干酪pH值分析

圖1 切達干酪成熟期pH值的變化Fig. 1 Change in pH of Cheddar cheese during ripening

由圖1可知，各成熟期的干酪樣品pH值整體上呈現出先下降后上升的規律，主要原因是成熟前期干酪中存在著殘留乳糖，附屬發酵劑和主發酵劑分解乳糖繼續產生酸性物質，使pH值下降，隨著成熟時間延長，乳糖被消耗殆盡，以及蛋白質降解產生肽和氨基酸等物質使干酪pH值上升[23]。在相同成熟期，由于附屬發酵劑代謝產生酸性物質，干酪C、D的pH值顯著低于對照組（P＜0.05），同時鉀離子提供的環境有利于微生物發酵[24]，使干酪B的pH值低于對照組干酪A，即鉀鹽替代和附屬發酵劑L. paracaseiM3的添加使干酪pH值降低。

2.3 干酪微生物分析

圖2 切達干酪成熟期細菌總數（A）和乳酸菌數（B）的變化Fig. 2 Changes in total bacterial count (A) and Lactobacillus count (B)in Cheddar cheese during ripening

細菌總數檢測是衡量乳制品質量安全的一個重要指標[25]。如圖2所示，總細菌數和乳酸菌數都隨成熟時間的延長呈現逐漸下降趨勢，且乳酸菌的數量低于總細菌，可能是由于隨著成熟期的進行，干酪的營養物質被消耗，碳源減少，微生物生存受限，在Pappa等[26]研究Kashkaval干酪中也得到的相似的結論。成熟6個月時干酪的細菌總數、乳酸菌數，干酪B高于對照組A，干酪D組顯著高于干酪C，說明鉀鹽的環境更有利于微生物的生長，Karimi等[27]研究的鉀鹽部分替代鈉鹽在Feta干酪也有類似的結果。在成熟期6個月時添加L. paracaseiM3的干酪C、D的乳酸菌數分別為7.90和8.26（lg（CFU/g）），顯著高于干酪A和B（P＜0.05），說明添加附屬發酵劑L. paracaseiM3使干酪乳酸菌數量增加，可能進而影響干酪蛋白質的水解和ACE抑制活性。

2.4 干酪pH 4.6可溶性氮分析

由圖3可知，各組干酪的pH 4.6可溶性氮的含量隨成熟時間呈現顯著上升的趨勢（P＜0.05），并在成熟6個月時分別達到20.16%、21.03%、22.46%、23.84%，主要原因是由于殘留在干酪中的凝乳酶以及發酵劑有較強的蛋白水解能力，有助于發生初級水解[28]，添加L. paracaseiM3的干酪C、D明顯高于對照組A，說明L. paracaseiM3促進蛋白水解產生中小分子肽[29]，鉀鹽替代的干酪B蛋白水解程度高于空白組A，說明鉀鹽提供了更有利于微生物的水解環境[30]。

圖3 切達干酪成熟期pH 4.6可溶性氮含量的變化Fig. 3 Change in pH 4.6-SN content in Cheddar cheese during ripening

2.5 干酪總游離氨基酸分析

表2 干酪成熟期總游離氨基酸含量Table 2 Total free amino acid content in Cheddar cheese during ripening

甘氨酸標準曲線方程y=0.008x-0.005 9（R2=0.995 3），干酪中的微生物尤其是乳酸菌產生的蛋白酶將初級水解得到的小肽再次進行次級水解得到游離氨基酸[31]。由表2可知，成熟時間對干酪的總游離氨基酸含量有顯著影響（P＜0.05），呈現上升的趨勢。在相同成熟期，添加L. paracaseiM3的干酪C、D顯著高于對照組干酪（P＜0.05），且第6個月都超過了20 mg/mL，分別比對照組提高了32.7%和43.3%，說明附屬發酵劑的添加是有利于深層次的蛋白水解。鉀鹽替代對干酪總游離氨基酸含量沒有顯著影響（P＞0.05）。

2.6 切達干酪ACE抑制活性分析

圖4 切達干酪成熟期ACE抑制率的變化Fig. 4 Change in ACE inhibitory activity of Cheddar cheese during ripening

由圖4可知，各組干酪在成熟期ACE抑制率呈現明顯上升的趨勢（P＜0.05），隨著蛋白水解深度進行，酶分解酪蛋白產生生物活性肽，其中包括ACE抑制肽，使其抑制率上升，郝欣悅等[32]將瑞士乳桿菌添作為益生菌加到切達干酪也發現相似結果。其中添加部分鉀鹽的干酪C高于對照組，主要原因是鉀離子環境增加了乳酸菌的蛋白酶活力[33]，從而有利于生物活性肽的生成。干酪B、C、D在成熟6個月之后ACE抑制率達到了65.2%、74.3%和78.7%，比空白組分別高出19.6%、36.2%和44.4%，說明L. paracaseiM3具有促進ACE抑制肽的產生，同時L. paracaseiM3在部分鉀鹽環境中酶活力更強。因此，在切達干酪配方中部分鉀鹽替代和附屬發酵劑有助于具有益生功能的生物活性肽的產生。從功能角度考慮，部分鉀鹽替代和附屬發酵劑在切達干酪配方中存在積極影響。

2.7 干酪質構分析

表3 干酪成熟6個月的質構分析Table 3 Texture analysis of Cheddar cheese after six months of ripening

由表3可知，膠黏性大小看其絕對值，負號代表受力方向向下，各組干酪隨成熟期的進行，硬度、彈性、內聚性、咀嚼性呈現下降趨勢且硬度、咀嚼性下降幅度較大，而膠黏性卻呈現上升趨勢。干酪B、C、D的硬度分別是（997.65±14.08）、（1 013.04±25.27）、（942.53±19.93）g顯著低于對照組A（P＜0.05），說明KCl提供的環境和L. paracaseiM3的加入促進微生物發生蛋白水解產生小分子物質以及肽鍵斷裂的程度更高，使酪蛋白的網絡結構受到更高程度的破壞并發生坍塌[34]，導致硬度降低，而彈性、內聚性、黏性、咀嚼性也因此發生相應的變化。總的來說，KCl和L. ParacaseiM3很好的加速了干酪的成熟。

2.8 切達干酪電子舌分析

圖5 切達干酪第6個月電子舌分析Fig. 5 Electronic tongue analysis of Cheddar cheese ripened for six months

如圖5所示，3個點代表樣品3個重復。PC1貢獻率為68.6%，PC2貢獻率為20.1%，PC1占據了主要的貢獻率，累計貢獻率超過80%，說明很好地代表樣品之間的整體信息，距離風味指標越近，說明樣品在這指標強度就越高[35]。PC1與苦味、豐富度、酸味呈正相關，PC2與咸味呈正相關。從PC1看出，干酪D的鮮味、酸味、豐富度、苦味高于其他組，說明鉀鹽替代和附屬發酵劑混合使用明顯影響著干酪的風味（P＜0.05）。

2.9 切達干酪感官評價分析

表4 切達干酪第6個月的感官評價分析Table 4 Sensory evaluation of Cheddar cheese ripened for six months

由表4可知，4 組切達干酪的色澤，質地以及裂縫沒有明顯的差別，說明部分鉀鹽替代以及附屬發酵劑的添加對干酪外觀幾乎沒有影響（P＞0.05）；干酪B、C、D的苦味值顯著大于對照組，說明KCl具有明顯的金屬苦味以及附屬發酵劑L. ParacaseiM3具有水解蛋白產生苦味肽的功能，干酪B、D咸味值顯著低于干酪A、C（P＜0.05），主要原因是KCl不僅提供咸味，還提供其他味道，而NaCl提供的味道比較單一咸味[36]，Li Feng等[37]研究部分KCl取代NaCl在臘肉中的咸味評價也得到相似結果。附屬發酵劑對干酪咸味幾乎沒有影響。

3 結 論

部分鹽替代和附屬發酵劑L. paracaseiM3單獨或者混合使用，對切達干酪主成分幾乎沒有影響，其中，附屬發酵劑的添加使干酪pH值下降，而微生物、pH 4.6可溶性氮、總游離氨基酸、ACE抑制率顯著增加，但是會使硬度有明顯下降，同時產生苦味肽，而部分鉀鹽替代，增加了微生物的存活，提高ACE抑制率但也降低硬度和伴隨金屬苦味的生成。總的來說，部分鉀鹽替代和附屬發酵劑影響干酪蛋白水解和有助于具有抗高血壓潛力的ACE抑制肽的產生。在后續的研究中，可以考慮添加風味增強劑來彌補附屬發酵劑和鉀鹽帶來的苦味和其他味道的缺陷。