抗生素對不同土壤中酶活性的影響

周椿富，于銳，王翔，闖紹闖，楊洪杏，謝越

安徽科技學院資源與環境院，安徽 鳳陽 233100

抗生素是由某些微生物產生或通過人工合成的，能夠起到抑制微生物和其他細胞增殖作用的一類化學物質（顧覺奮，2002；劉文英，2003）。由于可以促進動物生長和預防疾病（Baran et al.，2011；Liao et al.，2016），故作為飼料添加劑在畜禽養殖行業中廣泛應用，全球每年抗生素使用量約為10—20萬噸，其中70%用于畜牧業（Van et al.，2015；Qian et al.，2017；陳俊輝，2010；隋倩雯等，2015）。經人體或動物攝入的抗生素中 85%會以原形或代謝產物的形式排入環境且仍具有生物活性，并能轉化形成代謝物母體（Amorim et al.，2014；Topal et al.，2016；王冉等，2006）。土霉素（Oxytetracycline，OTC）等四環素類、恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）等第三代氟喹諾酮類、磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine，SM2）等磺胺類藥物因其具有廣譜高效的特點，當前在我國生產量最大，使用量最多，在畜禽養殖行業中廣泛應用（Yang et al.，2010；杜黎明等，2006；金彩霞等，2010；魏子艷等，2014），其在使用中產生的環境問題也備受關注。當前抗生素濫用造成嚴重的環境問題，土壤和水體中均檢測到大量抗生素殘留，其帶來的環境污染問題已成為研究熱點（Zhu et al.，2013；Qin et al.，2019）。

土壤酶是土壤的重要成分，參與土壤中所有復雜的生化過程，對土壤中營養物質轉化、養分固定與釋放起關鍵作用，與土壤供肥能力緊密相關，是目前評價土壤肥力的重要指標（劉超等，2019；陸琴等，2020）。張昊等（2012）在土霉素暴露對小麥根際抗生素抗性細菌及土壤酶活性的影響研究中發現，土壤磷酸酶、脫氫酶等活性在土霉素暴露環境中均有所下降。金蘭淑等（2013）研究表明，不同濃度四環素對土壤脲酶和土壤磷酸酶活性影響表現出差異，低濃度四環素促進土壤兩種酶活性，高濃度四環素抑制兩種土壤酶活性。閆賽紅（2015）在研究中發現，恩諾沙星單一污染在第14天對蔗糖酶活性具有促進作用，而第7、21、28天表現為抑制作用。張晨等（2018）研究了典型磺胺類抗生素對土壤酶活性的影響，結果表明磺胺甲惡唑和磺胺甲基嘧啶對土壤脫氫酶和過氧化氫酶活性產生抑制作用，而磺胺甲基嘧啶和磺胺噻唑對土壤脫氫酶及過氧化氫酶活性呈現誘導作用。然而，目前抗生素在不同類型土壤中對土壤酶活性的影響尚未見報道。通過開展抗生素對酸性、中性和堿性土壤中土壤酶活影響的研究，分析抗生素對土壤酶活性的影響，明確抗生素與土壤酶兩者間的關系。

因此，本研究以酸性、中性和堿性土壤為研究對象，通過添加土霉素、恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶進行處理，分析土壤中脲酶、過氧化氫酶和磷酸酶活性的變化情況，旨在揭示在抗生素殘留背景下農田土壤的生態系統功能穩定性，以期為抗生素污染農田土壤的恢復工作提供數據支持和科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

實驗土壤取自安徽省黃山市黃山區湯口鎮農田（30°07′N，118°18′E，pH 為 5.8），安徽省滁州市鳳陽縣安徽科技學院九華山試驗田（32°87′N，117°57′E，pH為7.1），安徽省滁州市鳳陽縣黃灣村水稻田（32°98′N，117°72′E，pH 為 7.6）。以五點取樣法采集距地表5—15 cm處土壤，在陰涼處風干后研磨過0.425 mm篩。

1.2 試驗設計

試驗設不同pH土壤（Ac：酸性、Ne：中性、Al：堿性），分別添加不同抗生素（CK：不添加抗生素、OTC：添加土霉素、ENR：添加恩諾沙星、SM2：添加磺胺二甲嘧啶），抗生素添加量見表1，共12個處理，每個處理3次重復。分別將500 g供試土樣分裝至盆缽中，每盆土樣添加抗生素后用蒸餾水完全潤濕并混勻，置于恒溫箱中培養28 d，培養期間保持土壤濕潤，采集0、7、14、21、28 d樣品于負20 ℃保存，用于檢測分析。

表1 不同土壤處理下的抗生素添加量Table 1 Antibiotic addition under different soil treatments

1.3 土壤酶的測定方法

各土壤酶活性參照關松蔭（1986）方法測定，脲酶活性采用苯酚鈉次氯酸鈉比色法測定，將10 g土樣與2 mL甲苯混合靜止15 min，加10 mL尿素溶液和20 mL檸檬酸鹽緩沖液混勻，37 ℃培養24 h后定容至100 mL，取1 mL濾液顯色后在578 nm下比色，最終以 g·kg-1（37 ℃，24 h）表示。磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法，將1 g土樣加入50 mL錐形瓶中，添加0.2 mL甲苯、4 mL緩沖液、1 mL 0.05 moL·L-1對硝基苯磷酸二鈉溶液，混勻后37 ℃下培養1 h，顯色后在410 nm下比色，最終以g·kg-1（37 ℃，24 h）表示。過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定，將3 g土樣加入150 mL錐形瓶中，添加40 mL蒸餾水和5 mL的0.3% H2O2混勻，震蕩20 min后添加5 mL的3.0 mol·L-1H2SO4，過濾后取25 mL濾液用0.1 mol·L-1KMnO4滴定至淡粉紅色，最終過氧化氫酶活性由單位干土消耗的 0.1 mol·L-1KMnO4含量計，以 g·kg-1（37 ℃，20 min）表示。

1.4 數據處理與分析

實驗數據應用Microsoft Excel 2010軟件計算平均值及標準偏差，應用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan氏多重比較檢驗，應用Origin 2022軟件進行圖件繪制。

2 結果與分析

2.1 抗生素對酸性土壤中土壤酶活性的影響

施加抗生素對酸性土壤中土壤酶活性的影響如圖 1。各試驗組酸性土壤中脲酶活性較對照組均顯著受到抑制，其中 SM2對酸性土壤中脲酶活性抑制程度最高，與對照組相比OTC、ENR和SM2對脲酶活性最高抑制率分別達 38.03%、74.31%和84.13%（圖1a）。添加OTC對酸性土壤中過氧化氫酶活性有先抑制后促進的作用，最高抑制率和促進率分別為41.43%和222.99%，添加ENR和SM2對酸性土壤中過氧化氫酶活性具有顯著促進作用，最高促進率分別為24.88%和268.25%（圖1b）。添加OTC對酸性土壤中磷酸酶活性具有先抑制后促進的作用，最高抑制率和促進率分別為 37.90%和71.63%；添加 ENR、SM2后對土壤中磷酸酶活性具有顯著促進作用，最高促進率分別為 43.72%和51.21%，但分別在21 d和7 d后促進效果減弱并逐步抑制，其中添加ENR第28天磷酸酶活性與對照組基本持平，而添加SM2第21天后磷酸酶活性顯著降低，最大抑制率為76.28%（圖1c）。

圖1 抗生素對酸性土壤中酶活性的影響Figure 1 Effect of antibiotics on enzyme activity in acid soil

2.2 抗生素對中性土壤中土壤酶活性的影響

施加抗生素對中性土壤中土壤酶活性的影響如圖2。中性土壤添加OTC、ENR和SM2與對照組相比，均顯著抑制中性土壤中脲酶活性，最高抑制率分別為 70.88%、73.70%和 76.96%（圖 2a）。然而對過氧化氫酶活性均起到顯著促進效果，最高促進率分別為73.13%、51.05%和124.09%，但添加ENR對于過氧化氫酶活性的促進作用呈先增強后逐漸減弱趨勢，第 28天時過氧化氫酶活性低于對照組（圖2b）。中性土壤中添加OTC和ENR對土壤中磷酸酶活性均產生先抑制后促進的效果，其中添加OTC后，磷酸酶活性在0—14 d內顯著降低，且在第14天抑制效果最明顯，抑制率為48.74%，之后活性逐漸上升并顯著高于對照組，并在28 d促進程度最高，促進率為101.26%；添加ENR后，對磷酸酶在0—7 d內顯著降低，7—21 d內顯著增高，21 d后逐漸趨于一致，最高抑制和促進率分別為5.78%和17.26%；添加SM2后磷酸酶活性較對照組具有先促進后抑制的效果，在0—14 d內顯著提升，14 d后促進程度逐漸減弱，抑制效果加強，21—28 d磷酸酶活性顯著低于對照組，該組最大促進率和抑制率分別為33.24%和65.15%（圖2c）。

圖2 抗生素對中性土壤中酶活性的影響Figure 2 Effect of antibiotics on enzyme activity in neutral soil

2.3 抗生素對堿性土壤中土壤酶活性的影響

施加抗生素對堿性土壤中土壤酶活性的影響如圖3。添加OTC與對照組相比對脲酶活性具有先抑制后促進效果，添加OTC后的0—14 d內脲酶活性受到顯著抑制，抑制率達56.48%，14 d后抑制效果逐漸減弱，21—28 d脲酶活性顯著上升并在28 d達到最高，最高促進率為28.43%；添加ENR和SM2對堿性土壤中脲酶活性均具有顯著抑制作用，且抑制效果隨時間推移逐漸增強，在第28 d抑制程度最高，抑制率分別為55.88%和96.08%（圖3a）。添加OTC、ENR和SM2對過氧化氫酶活性均具有促進作用，其中添加OTC和SM2后對土壤中過氧化氫酶活性促進作用較對照組相比持續顯著提高，第28天促進程度最高，最高促進率分別為 92.04%和102.17%，而添加ENR后促進效果隨培養時間先上升后下降，最高促進率為46.73%，在第28天過氧化氫酶活性顯著低于對照組（圖3b）。添加OTC對磷酸酶活性具有先抑制后促進的作用，添加 OTC后0—14 d內磷酸酶活性顯著降低，14 d后抑制效果逐漸減弱，磷酸酶活性逐漸增強，21—28 d磷酸酶活性顯著高于對照組，但21 d后促進效果減弱，該組最高促進率和抑制率分別為 205.93%和86.62%；添加ENR和SM2對磷酸酶活性均具有先促進后抑制的作用，其中添加ENR后磷酸酶活性在0—21 d內顯著提升，最高促進率為65.19%，但21 d后促進效果減弱；添加SM2對磷酸酶活性在0—7 d內具有顯著促進作用，7 d后促進效果減弱，抑制程度加深，21 d后磷酸酶活性顯著低于對照組，最高促進率和抑制率分別為 35.22%和73.33%（圖3c）。

圖3 抗生素對堿性土壤中酶活性的影響Figure 3 Effect of antibiotics on enzyme activity in alkaline soil

3 討論

土壤酶作為土壤生物化學特征的主要成分，以“催化劑”的作用參與到土壤中各種物質交換和能量流動過程（Jabborova et al.，2021）。有研究表明，土壤中的脲酶能夠影響土壤的供氮水平；過氧化氫酶能夠影響腐殖質的分解與合成及化合物氧化速率，并對土壤中有害物質也具有分解作用；磷酸酶能夠通過酶促反應分解土壤中難溶性有機磷從而提升土壤中有效磷含量（Ma et al.，2020；Chen et al.，2021；Siwach et al.，2021）。因此，土壤酶活性在土壤肥力的改變中起到重要作用。本研究中，抗生素對土壤中土壤酶活性的影響與抗生素的類型、土壤的類型及暴露時間都有著密切關系。已有資料表明，抗生素的類型、土壤的類型及暴露時間均會對土壤酶活性產生影響（Zhang et al.，2013）。

3.1 抗生素對不同土壤中脲酶活性的影響

本研究發現，3種抗生素對不同土壤中脲酶活性均有明顯的抑制作用，這可能是抗生素的毒害作用導致土壤微生物的死亡，從而導致脲酶活性受到抑制。其中，OTC能夠通過特異性地與糖體30S亞基中A點位結合，阻止氨基酰-tRNA在該位點上的聯結，影響蛋白質的合成，從而致死微生物；ENR能夠作用于細菌遺傳物質核酸、DNA螺旋酶的 A亞單位，通過影響酶的正常功能抑制DNA合成與復制，使細胞不再分裂導致微生物的死亡；磺胺類藥物與氨基苯甲酸（PABA）具有類似結構，二者產生競爭關系影響微生物細胞內二氫葉酸合成酶，進而抑制四氫葉酸的含量并抑制微生物的增殖（徐東峰，2000；程章，2009）。因此認為這 3種抗生素會通過影響土壤中相關微生物活性，最終導致脲酶活性的降低。通過比較OTC在不同土壤pH下對脲酶的影響趨勢發現，在培養周期內，OTC在酸性與中性土壤中可以持續抑制脲酶活性，而在堿性土壤中呈現出先抑制后解除的變化趨勢。而這一現象的可能原因是 OTC在酸性與中性土壤中的穩定性更高，而在堿性土壤中容易降解（范菲菲等，2013）。張書菡（2019）在抗生素抑制土壤脲酶的毒性效應與機制的研究中發現，四環素類、β-內酰胺類等抗生素對土壤中脲酶活性均有很強的抑制作用，與本研究結果一致。Lahr et al.（2005）研究表明，土霉素等抗生素對土壤微生物呼吸具有抑制作用，而呼吸作用反映微生物總活性，微生物活性的降低會導致酶活的減弱，也從側面驗證了本研究結果。

3.2 抗生素對不同土壤中過氧化氫酶活性的影響

本研究發現，3種抗生素對不同土壤中過氧化氫酶活性均有明顯的促進作用。當土壤微生物受到抗生素毒害時會產生脅迫作用，需要分泌更多過氧化氫酶來抵抗土霉素毒害（劉莉莉等，2008）。張文婕等（2020）研究結果表明，施加中低濃度的恩諾沙星土壤中的過氧化氫酶具有相對明顯的激活作用，這與本研究結果相一致。吳杰等（2019）的研究結果表明，磺胺二甲嘧啶對微生物群落有激活作用，可能正是這種激活作用促進微生物對過氧化氫酶的分泌，使得過氧化氫酶活性呈不斷提高的結果。此外，還有研究結果顯示，土壤中的有機質對于土壤酶本身具有一定的保護作用（汪杏等，2016），并且土壤對于抗生素具有一定的吸附緩沖效果，從而造成了抗生素對于土壤酶的毒害作用得到緩解的現象，并結合微生物受到抗生素毒害所產生的脅迫作用，最終表現出對于過氧化氫酶活性的促進作用。

3.3 抗生素對不同土壤中磷酸酶活性的影響

本研究發現，3種抗生素對不同土壤中磷酸酶活性的影響情況較為復雜，其中 OTC對于不同土壤中磷酸酶活性均呈現先抑制后促進的作用，ENR對酸性、堿性土壤中磷酸酶活性呈現先促進后抑制的作用而對中性土壤中磷酸酶活性呈現先抑制后促進的作用，SM2對不同土壤中磷酸酶活性均呈現先促進后抑制的作用。其造成不同抗生素、不同土壤環境中磷酸酶活性變化差異的主要原因，可能是抗生素毒害作用和微生物由此產生的脅迫作用共同影響導致的。陳智學（2013）進行了土霉素對酶活性及微生物群落代謝影響的研究，其結果表明，受土霉素影響后磷酸酶活性處于先降后升再降的變化趨勢，與本研究結果一致。毛書帥（2016）研究結果也表明，單獨施加恩諾沙星7 d后對土壤磷酸酶活性具有激活作用。Liu et al.（2009）研究結果表明，磺胺二甲嘧啶對磷酸酶有顯著影響，且楊玖（2014）研究結果也表明，磺胺二甲嘧啶對磷酸酶活性會產生顯著的抑制作用，試驗結果均與本試驗結果一致。

由于土壤性質的不同，抗生素在不同土壤中的吸附、解吸、遷移轉化也會存在差異。鮑艷宇（2008）研究發現，四環素類抗生素在不同土壤中都是物理吸附，但在不同土壤中的解吸具有一定程度的滯后性和差異性。本研究中，酸性和中性土壤中添加OTC后，脲酶活性持續受到抑制，而堿性土壤中添加 OTC則出現先抑制后促進的現象，可能是由于不同酸堿度土壤對于OTC的吸附所存在的差異性，同樣的差異性也體現在酸性土壤中添加 OTC后過氧化氫酶活性變化與中、堿性土壤中添加 OTC的不同。李鑫（2015）在四環素類抗生素在不同質地土壤中的遷移模擬研究中發現，不同質地土壤對四環素和土霉素的吸附存在快速吸附過程和慢速平衡過程的不同，四環素和土霉素在砂土中具有明顯的遷移效果。本研究中，3種不同抗生素添加到 3種土壤中，磷酸酶活性變化情況出現較為明顯差異，可能是由于土壤的機械組成對抗生素的吸附和遷移產生了影響所導致的。

單一的污染物其自身的理化性質決定了其對于土壤微生物的毒性效應，而復合污染條件下，污染物的理化性質及污染物的濃度等眾多因素均對其最終毒性效應產生同等重要的作用。張晨等（2018）通過典型磺胺類抗生素對土壤脫氫酶和過氧化氫酶活性的影響研究表明，復合污染物對土壤酶活性的效應與染毒質量比及土壤酶的種類等均相關。李凱旋（2018）在研究中發現，三氯生和克拉霉素復合污染情況下對土壤脲酶活性表現為高濃度抑制效應，而對過氧化氫酶活性表現為低濃度抑制。復合污染物的作用機理可為競爭結合位點、影響生物酶活性等多種途徑產生作用（Ensenbach et al.，1997；Donnelly et al.，1998），并產生不同效果，但當前對于復合抗生素污染物對土壤酶活性影響的研究還較少。本研究補充了抗生素殘留背景下不同類型土壤的土壤酶活變化情況，但由于影響土壤酶敏感性的生物和理化因素的復雜性，研究僅分析了抗生素對酶活的相對作用，還需要進一步的研究來確定微生物數量、活動和群落組成變化的情況，更準確的揭示抗生素影響下土壤生態系統功能穩定性及其驅動機制。

4 結論

本實驗通過采集不同土壤樣本，對土壤添加抗生素進行試驗，研究土霉素、恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶3種抗生素對酸性、中性和堿性土壤中土壤酶活性的影響。實驗結果表明，3種抗生素處理后，農田土壤中脲酶活性整體呈現抑制趨勢，過氧化氫酶活性整體呈現促進趨勢，磷酸酶活性在不同抗生素之間存在顯著的差異性。抗生素的殘留會削弱土壤氮循環相關酶的代謝功能及穩定性，從而減弱土壤物質循環及土壤生態系統的功能穩定性。