山蒼子植株再生體系的優化*

王 陽 張付豪 竇 敏 許 婷 陳 昊

(中南林業科技大學經濟林培育與保護教育部重點實驗室 中南林業科技大學經濟林育種與栽培國家林業和草原局重點實驗室 長沙 410004)

山蒼子(Litseacubeba)為樟科木姜子屬的落葉灌木或小喬木，廣布于我國長江以南各省區，其中湖南省是我國山蒼子種質資源的主要分布區之一，在低山和丘陵區均有分布(谷戰英等， 2017)。山蒼子作為中國特色芳香油植物資源之一，其葉、花和果皮均含有芳香油，是重要的芳香植物(劉曉棠等， 2008)。從山蒼子果實和葉子中所提取的山蒼子油中醛類成分約占總成分的70%(Lietal.， 2014)，其中檸檬醛含量高達60%～90%(吳厚玖等， 1997)。檸檬醛是生產抗氧化劑、殺蟲劑、抗微生物藥物的重要原料，在香料工業和醫療工業上有重要用途(Luoetal.， 2004； Ameretal.， 2006； 喻阿坤等， 2019)。

受檸檬醛等代謝產物的影響，山蒼子枝條傷口處易被氧化，使得山蒼子扦插和嫁接較為困難，目前，山蒼子主要以野生植株的種子進行實生繁殖，但其種子發芽率較低，常導致育苗失敗。此外，山蒼子屬于雌雄異株植物，實生苗木會發生性狀分離，導致其優良性狀在雜種后代中難以保存(吳松成等， 2003； 王玉昆等， 2005)。植物組織培養技術因具有繁殖系數高、繁殖速度快和易保持母體優良性狀等優點，目前已成為工廠化育苗的重要途徑(Robertonetal.， 1988； Thomas， 2008； Kimetal.， 2017)。此外，建立愈傷組織誘導與不定芽分化體系可為植物遺傳轉化研究提供技術支撐。因此，建立高效的山蒼子愈傷組織誘導及植株再生體系，不僅可以進行山蒼子良種的工廠化繁育，還可以為山蒼子遺傳轉化體系的建立奠定基礎。

目前，關于山蒼子組織培養研究的報道相對較少。Mao等(2000)研究發現，6-BA是山蒼子莖尖誘導不定芽的適宜細胞分裂素。尹紅(2000)以山蒼子莖段為外植體，篩選出愈傷組織形成的適宜激素質量濃度組合和pH值。通過對不同外植體的脫分化效果進行比較發現，莖段外植體盡管愈傷組織誘導效率高于葉片外植體，但其誘導效率和狀態仍不能滿足后續增殖和分化的要求(馬崇堅等， 2005； 雷明等， 2008)。通過后續研究的改進，山蒼子莖段愈傷組織的誘導率可達100%，但不定芽分化率低，最高僅為28.57%，且分化出的不定芽生根率僅為45.33%，也未進行后續再生植株的移栽試驗(林麗媛等， 2013)。已有研究結果表明，山蒼子組織培養過程中存在愈傷組織誘導效率不穩定，再分化與生根效率低，未進行再生植株移栽試驗等問題，尚不能應用于種苗工廠化繁育。鑒于此，本研究以山蒼子莖段為外植體，進行山蒼子組培條件的優化和再生植株的移栽試驗，通過對愈傷組織誘導和增殖條件的比較，獲得具有分化能力的愈傷組織，并對不定芽分化和生根條件進行了優化，顯著提高了山蒼子不定芽分化率與生根率，再生植株移栽成活率高，可以滿足山蒼子良種的工廠化繁育需求，為后續山蒼子遺傳轉化體系的建立提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取種植于中南林業科技大學山蒼子實驗基地的健康、無病蟲害的山蒼子優良雌株，取其春稍半木質化莖段的節間(不帶芽)作為誘導愈傷組織的外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的表面滅菌 將外植體置于玻璃瓶中，先用洗衣粉浸泡15min，再于流水下沖洗1 h后，轉至超凈工作臺上進行外植體的表面滅菌處理。75%的乙醇處理外植體25 s，用0.1%的HgCl2處理8min，無菌水沖洗4～5次，最后用無菌濾紙吸干外植體表面的水分(張付豪等， 2019)。在培養皿中將莖段切為0.5cm長的小段，將其橫放于培養基上。

1.2.2 山蒼子愈傷組織的誘導 以1/2 MS培養基為基本培養基，附加的植物生長調節劑為6-芐氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、萘乙酸(naphthylacetic acid，NAA)，按照正交試驗設計L9(33)，設9個處理，每個處理接種10瓶，每瓶接種3個外植體，重復3次。28天后觀察并統計愈傷組織誘導率、褐化率及生長狀況。

1.2.3 愈傷組織的繼代增殖 將愈傷組織從莖段上切下并去除褐化部分后，接種到含不同質量濃度6-BA、NAA的1/2 MS培養基上。按照正交試驗設計L9(32)，設9個處理，每個處理接種10瓶，每瓶接種3～5塊愈傷組織，重復3次。28天后觀察并統計愈傷組織增殖系數、質地及生長狀況。

1.2.4 不定芽分化 將致密的愈傷組織接種到含不同質量濃度6-BA和吲哚丁酸(indole-3-butyric acid，IBA)的1/2 MS培養基上。按照正交試驗設計L9(32)，設9個處理，每個處理接種15瓶，每瓶接種2塊愈傷組織，重復3次。28天后觀察并統計不定芽分化率及平均不定芽數。

1.2.5 生根培養 將生長至3～5cm的不定芽轉至含不同質量濃度IBA和活性炭的1/2 MS培養基上。按照正交試驗設計L9(32)，設9個處理，每個處理接種10瓶，每瓶接種1個不定芽，重復3次。28天后記錄生根情況，統計不定芽生根率及平均根數。

1.2.6 煉苗與移栽 將生長健壯和根系粗壯的再生植株先擰松組培瓶瓶蓋煉苗1天，隨后以瓶蓋半開狀態煉苗1天，最后從組培瓶中取出，洗凈根系上附著的培養基后，置于盛有水的玻璃瓶中完全打開瓶蓋煉苗2天。煉苗完成后將其移栽于營養土、營養土∶珍珠巖= 3∶1(V/V)、紅壤土∶營養土∶珍珠巖= 2∶1∶1(V/V)、紅壤土∶營養土∶珍珠巖= 1∶1∶1(V/V)的移栽基質中，移栽后放置于濕度為60%～70%的人工氣候室，覆蓋一層保鮮膜保濕培養2天后揭取。移栽28天后統計移栽成活率。

1.3 培養條件

本研究培養基中均添加30 g·L-1蔗糖(除生根培養基中添加20 g·L-1蔗糖外)、7 g·L-1瓊脂，pH值調至5.8，于121℃高壓滅菌20min后使用。組培材料放置于培養溫度為(25±2)℃，光照強度為20μmol·m-2s-1，光照時間為14 h·d-1的培養室內培養。

1.4 數據統計

愈傷組織誘導率=形成愈傷組織的外植體數/接種成活的外植體數× 100%； 愈傷組織褐化率=愈傷組織褐化數/接種的愈傷組織數× 100%； 愈傷組織增殖系數=增殖后的愈傷組織質量/增殖前的愈傷組織質量； 不定芽分化率=分化出不定芽的愈傷組織數/接種的愈傷組織數× 100%； 不定芽生根率=生根的不定芽數/接種的不定芽數× 100%； 再生植株移栽成活率=移栽成活的再生植株數/移栽的再生植株數× 100%； 采用SPSS 25.0和Excel 2010對試驗數據進行整理、統計和分析。

2 結果與分析

2.1 植物生長調節劑對莖段愈傷組織誘導的影響

由表1可知 ，不同植物生長調節劑配比的誘導培養基上，山蒼子莖段愈傷組織的誘導率均為100%，但愈傷組織褐化率及生長狀況存在顯著差異。各因素不同水平下極差的大小反應其對山蒼子愈傷組織褐化率的影響程度，極差分析發現，對愈傷組織褐化率的影響由高到低依次為6-BA、2,4-D和NAA。6-BA質量濃度的增加導致愈傷組織褐化率顯著升高，當6-BA質量濃度為0.2 mg·L-1時，處理1(添加2,4-D)和處理2(添加NAA)的褐化率最低，但二者的愈傷組織狀態存在顯著差異。處理2誘導的愈傷組織結構致密，誘導量多，而處理1誘導的愈傷組織結構較致密，誘導量少。當6-BA質量濃度為2.0 mg·L-1時，愈傷組織褐化率最高，誘導量極少，生長狀態差。

以上結果表明，低質量濃度的6-BA適宜山蒼子愈傷組織的誘導，處理2(1/2 MS + 0.2 mg·L-16-BA + 0.3 mg·L-1NAA + 30 g·L-1蔗糖 + 7 g·L-1瓊脂)為山蒼子莖段愈傷組織誘導的最適培養基，其愈傷組織的誘導率為100%，誘導出的愈傷組織為淡黃色，質地致密，生長量大，生長狀態較好，不易發生褐化。將山蒼子莖段接種于處理2培養基上培養7天后，莖段兩端切口處開始膨大，并出現淡黃色愈傷組織，繼續培養21天后，愈傷組織體積增大，質地致密(圖1A、B)。

2.2 植物生長調節劑對愈傷組織繼代增殖的影響

由表2可知，6-BA對山蒼子愈傷組織的增殖系數影響最大，其次為NAA。6-BA質量濃度的增加，導致愈傷組織增殖系數顯著降低，在相同6-BA質量濃度下，隨著NAA質量濃度的升高，增殖系數呈現逐漸上升的趨勢。不同質量濃度6-BA和NAA組合的培養基上，愈傷組織的質地顯著不同，其中處理8的愈傷組織為疏松顆粒狀，顏色較綠(圖2A)，增殖系數最高，達3.80。處理7的愈傷組織質地致密，顏色較暗，有光澤(圖2B)，增殖系數為3.43，與處理8差異不顯著。當6-BA質量濃度為1.5 mg·L-1時，愈傷組織均表現為疏松水漬狀(圖2C)，生長狀況較差，且隨著培養時間的延長，褐化程度逐漸加重甚至死亡(圖2D)。在本研究后續的不定芽分化試驗中發現，致密型愈傷組織具有再分化能力，可分化出不定芽，而疏松顆粒狀愈傷組織增殖系數較高，但不具備再分化能力，且隨著繼代次數的增加逐漸褐化死亡。

以上結果表明，低濃度的6-BA和高質量濃度的NAA適宜于山蒼子愈傷組織的增殖。通過綜合比較，處理7和處理8的增殖系數盡管均較高，但處理7誘導形成的愈傷組織致密，生長狀況良好，更利于后續分化，因此，處理7(1/2 MS + 0.5 mg·L-16-BA + 1.0 mg·L-1NAA + 30 g·L-1蔗糖 + 7 g·L-1瓊脂)為山蒼子愈傷組織繼代增殖的最適培養基。將生長一致的愈傷組織接種于處理7的培養基上培養7天時，愈傷組織無明顯變化，繼續培養21天時，愈傷組織體積明顯增大，生長狀態良好(圖1C、D)。

表1 植物生長調節劑對山蒼子莖段愈傷組織誘導的影響①

2.3 植物生長調節劑對不定芽分化的影響

由表3可知，當不定芽分化培養基中未添加6-BA和IBA以及IBA質量濃度高于6-BA時，愈傷組織未分化出不定芽。當6-BA和IBA質量濃度均較高時，不定芽分化率和平均不定芽數極低。隨著IBA質量濃度的降低，不定芽分化率和平均不定芽數也逐漸升高，當IBA質量濃度為 0.1 mg·L-1時，山蒼子不定芽分化率和平均不定芽數均顯著高于1.0 mg·L-1的處理。在添加0.1 mg·L-1IBA的處理中，6-BA質量濃度從2.0 mg·L-1降低到0.5 mg·L-1時，山蒼子不定芽分化率顯著提高，當6-BA質量濃度為0.5 mg·L-1時，不定芽分化率和平均不定芽數均最高，分別為45.59%和8.14。因此，6-BA和IBA質量濃度均較低時，有利于山蒼子不定芽分化。

以上結果表明，6-BA和IBA的較低質量濃度配比是山蒼子不定芽分化的關鍵。處理1(1/2 MS + 0.5 mg·L-16-BA + 0.1 mg·L-1IBA + 30 g·L-1蔗糖 + 7 g·L-1瓊脂)為山蒼子不定芽分化的最適培養基，不定芽分化率最高，為45.59%，分化旺盛，平均不定芽數達8.14，不定芽生長狀態較好。將狀態良好的愈傷組織接種到處理1的培養基上培養7天時，愈傷組織逐漸出現芽點(圖1E)； 培養14天時，愈傷組織體積逐漸變大，表面開始分化出較多不定芽(圖1F)； 培養21天時，愈傷組織表面的不定芽明顯長大(圖1G)； 培養28天時，不定芽生長旺盛(圖1H)。

表2 植物生長調節劑對山蒼子愈傷組織繼代增殖的影響①

圖1 山蒼子莖段愈傷組織誘導和植株再生過程

表3 植物生長調節劑對山蒼子不定芽分化的影響①

圖2 山蒼子愈傷組織繼代過程中的不同質地

2.4 IBA和活性炭對不定芽生根的影響

由表4可知，IBA和活性炭對山蒼子不定芽生根率及平均根數具有顯著影響。在添加活性炭的培養基中，盡管根生長迅速，但生根率較低，根數少，根細長，長勢弱，移栽不易成活(圖3A)。在不添加活性炭的培養基中，生根率高，根萌發快，生根數多，根粗壯，移栽易成活(圖3B、C)。由此認為，添加活性炭可能不利于山蒼子不定芽生根。無論培養基中是否添加活性炭，當培養基中IBA質量濃度從0.2 mg·L-1提高到1.0 mg·L-1時，生根率都呈先升高后降低的趨勢(表4)。在不添加活性炭的培養基中，IBA質量濃度為0.5 mg·L-1時的不定芽生根率和平均根數顯著高于其他質量濃度(表4)。

綜合分析以上結果，選擇處理2(1/2 MS + 0.5 mg·L-1IBA + 20 g·L-1蔗糖 + 7 g·L-1瓊脂)為山蒼子不定芽生根的最適培養基，不定芽生根率達93.33%，平均根數達6.74，根粗壯，再生植株生長健壯。將山蒼子不定芽接種于處理2培養基上培養14天時，不定芽莖段皮部開始萌發出根； 培養28天時，根粗壯，長勢良好(圖1I、J)。

表4 IBA和活性炭對山蒼子不定芽生根的影響①

圖3 添加活性炭(A)與不添加活性炭(B和C)的培養基上誘導形成的不定根對比

2.5 不同移栽基質對山蒼子再生植株移栽成活的影響

由表5可知，不同移栽基質對山蒼子再生植株移栽成活具有顯著影響。將山蒼子再生植株移栽至營養土∶珍珠巖(V/V= 3∶1)的混合基質中時，移栽成活率最高(83.33%)，移栽至其他基質中時，移栽成活率均較低，最低僅為27.78%。因此，將山蒼子再生植株移栽至營養土∶珍珠巖(V/V= 3∶1)的混合基質中培養7天后，葉片展開，移栽植株生長狀況良好(圖1K)，培養28天后，移栽植株生長健壯，植株長高，葉片長大，有新葉長出，無病蟲害現象發生(圖1L)。

表5 基質對山蒼子再生植株移栽成活的影響

3 討論

植物生長調節劑的種類、質量濃度和配比是影響愈傷組織誘導和增殖以及愈傷組織褐化的關鍵因素(郎玉濤等， 2007； 李琰等， 2010)。雖然添加適宜濃度的2,4-D有利于多種植物愈傷組織的形成(符文英等， 2004； Leeetal.， 2012； 矯麗曼等， 2017)，但本研究發現NAA更有利于山蒼子莖段愈傷組織的誘導和增殖。有研究表明，高濃度的6-BA可刺激愈傷組織產生酚類物質，酚類物質被氧化后產生的醌類物質可抑制愈傷組織的生長(李冬杰等， 2005)。本研究發現，高濃度的6-BA同樣易使山蒼子愈傷組織發生褐化，導致其死亡，因此，本研究選擇較低濃度的6-BA以及適宜濃度的NAA進行愈傷組織的誘導和增殖培養，愈傷組織的誘導率可達100%，愈傷組織在后續培養中也具有較高的增殖系數。

前人研究表明，不定芽分化與不同愈傷組織質地聯系密切，只有適宜的愈傷組織質地才能誘導分化出不定芽(張文泉等， 2018)。本研究發現，在山蒼子愈傷組織繼代增殖過程中，不同培養基上增殖培養的愈傷組織在質地上存在明顯差異，只有致密型愈傷組織具有分化能力，隨著繼代次數的增加仍可不斷分化； 而疏松顆粒狀愈傷組織和疏松水漬狀愈傷組織均不具備分化能力，且隨著繼代次數的增加逐漸褐化死亡。木本植物培養中愈傷組織分化不定芽是較難的一個環節，不定芽分化率的高低不僅與愈傷組織的質量有關，還需要較高濃度的細胞分裂素和較低濃度的生長素，這不僅取決于植物生長調節劑的種類，還取決于它們之間的比例(譚曉風等， 2013； 辛亞龍等， 2017； 馬彥軍等， 2017； 袁云香， 2020)。本研究同樣發現，當生長素濃度高于細胞分裂素濃度時，有利于山蒼子愈傷組織的誘導與增殖； 當細胞分裂素濃度高于生長素濃度時，有利于山蒼子不定芽分化。前人對山蒼子愈傷組織誘導和植株再生研究中發現，添加為2.0 mg·L-1的6-BA和0.1 mg·L-1的IBA有利于不定芽分化，不定芽分化率為28.57%，平均不定芽數最高為2.86； 當6-BA濃度從2.0 mg·L-1升高至5.0 mg·L-1時，不定芽分化率逐漸降低，愈傷組織褐化死亡率也逐漸升高(林麗媛等， 2013)。而本研究發現，6-BA和IBA的較低濃度配比有利于山蒼子不定芽分化。在添加0.1 mg·L-1或0.5 mg·L-1IBA的培養基中，隨著6-BA添加濃度的降低，山蒼子不定芽分化率及平均不定芽數均逐漸升高。當添加0.5 mg·L-1的6-BA和0.1 mg·L-1的IBA時，不定芽分化率最高，可達45.59%，平均不定芽數可達8.14，顯著提高了山蒼子不定芽分化率及平均不定芽數。

蔗糖是植物組織培養基的重要成分，其濃度不僅影響愈傷組織誘導、增殖和不定芽分化，也對生根有一定的影響。有研究表明，較低的蔗糖濃度有利于試管苗生根(劉均利等， 2020)。而前人對山蒼子不定芽生根培養研究中，在添加濃度為30 g·L-1蔗糖的培養基上，生根率最高僅為45.33%(林麗媛等， 2013)。因此，本研究進行生根培養時，將前人所使用的蔗糖濃度從30 g·L-1降低到20 g·L-1，并添加濃度為0.5 mg·L-1的IBA，顯著提高了不定芽的生根率(高達93.33%)，誘導出的根較粗，移栽易成活。此外，培養基中添加活性炭具有吸附酚類等有害物質含量的作用，對許多植物的生根具有一定的促進作用(劉根林等， 2001； Chutipaijitetal.， 2018)。但本研究發現，不添加活性炭誘導出的根較粗，移栽易存活，而添加活性炭誘導出的根萌發較慢，根細長，長勢較弱，移栽不易存活，這可能是由于活性炭的吸附作用降低了生長素的濃度而影響山蒼子不定芽的生根。

移栽成活是工廠化繁育的關鍵，而移栽基質是試管苗移栽成活的基礎，通常移栽基質要求可以提供根系所需要的養分，并保持一定的含水量(陳寶玲等， 2014)。本研究發現，添加紅壤土會使山蒼子再生植株移栽不易存活，這可能是由于紅壤土易板結，會限制根系生長。而營養土含有大量礦物質和有機質，能為再生植株生長提供所必須的營養。將珍珠巖與營養土混合，可以增加土壤透氣性，防止土壤板結，促進根系生長。因此，本研究使用營養土與珍珠巖的混合基質用于山蒼子再生植株的移栽，獲得了較高的移栽成活率。

4 結論

本研究以山蒼子莖段為外植體進行離體培養，建立了植物再生體系，該培養體系顯著提高了山蒼子不定芽的分化率與生根率，再生植株移栽成活率高，研究結果為山蒼子良種的工廠化繁育奠定了基礎，也為山蒼子遺傳轉化體系的建立提供了技術支撐。