一種新型復配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺對松材線蟲毒力藥效*

倪安順 王永春 楊 丹 孫學書 葉建仁

(1.南京林業大學林學院 南方現代林業協同創新中心 南京 210037； 2.杭州益森鍵生物科技有限公司 杭州 311100)

松樹萎蔫病又稱松材線蟲病，是由松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)引起的一種系統侵染性病害，能短時間造成松屬(Pinus)樹種大量萎蔫死亡。該病害起源于北美，目前主要分布在加拿大、墨西哥、美國、中國、日本、韓國、葡萄牙和西班牙等(王曦茁等， 2018)，亞洲是受松材線蟲病影響最嚴重的地區。我國于1982年在南京中山陵首次發現松材線蟲病(孫永春， 1982)，目前已擴散至全國19個省、731個縣級行政區，發生面積已超過180萬hm2，探尋有效的防病措施已經迫在眉睫。

松材線蟲病的防控途徑目前主要有檢疫、監測、疫木除治、媒介昆蟲防治、樹干注射預防等(葉建仁， 2019)，其中樹干注射預防因簡便高效，有持效性等優點，應用面積愈來愈大，已經成為當前防治松材線蟲病的重要手段之一。樹干注射的有效性主要依賴于化學藥劑在樹木木質部的移動(Navarroetal.， 1992)，化學藥劑在樹體內的運輸依靠水的流動，化合物的水溶性對其防治效果尤為重要(Takaietal.， 2001)。目前，用于樹干注射預防的化學藥劑主要是甲維鹽和阿維菌素，在21 ℃時的水溶性只有10μg·L-1(Cabreraetal.， 2013)，水溶性差可能是制約它們在樹體內發揮作用的一個重要因素，長期使用甲維鹽和阿維菌素也容易使松材線蟲產生抗藥性 (Zhaoetal.， 2006)。因此，亟需尋找新的、更加有效的殺線劑應用于松材線蟲病的預防實踐。

氟吡菌酰胺(Fluopyram)是吡啶類殺菌劑，通過抑制琥珀酸脫氫酶的電子轉移而抑制線粒體呼吸，具有廣譜性和內吸性，可防治真菌病原菌引起的菌核病(Sclerotiniasclerotiorum)、白粉病(Erysiphegraminis)和霜霉病(Peronosporaaestivalis)等(Labourdetteetal.， 2010)。近年來，拜耳作物科學公司發現氟吡菌酰胺還具有優良的殺線蟲活性，并在2015年登記該藥劑在殺線蟲方面的應用(楊子輝等， 2017)。研究發現，氟吡菌酰胺對南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)、小麥孢囊線蟲(Heteroderaavenae)、腎型腎狀線蟲(Rotylenchulusreniformis)具有良好的殺線效果(遲元凱等， 2019； Faskeetal.， 2015)，但是該藥劑對于松材線蟲的作用效果研究報道卻極少。此外，氟吡菌酰胺在20℃時的水溶性為16 mg·L-1(楊子輝等， 2017)，遠高于甲維鹽和阿維菌素(10μg·L-1)，更易被樹體吸收運輸，有望成為一種良好的樹干注射預防松材線蟲新藥劑。

不同藥劑復配使用是延緩線蟲抗藥性和提高藥效的一個重要途徑。本研究通過對比2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺復配藥劑與5%氟吡菌酰胺、5%阿維菌素單獨施用對于松材線蟲的生長繁殖的影響，來探究2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺作為一種新型復配殺線劑在防治松材線蟲病方面的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蟲源： 試驗線蟲為南京林業大學森林保護實驗室保存的松材線蟲強毒力蟲株AMA3蟲株。

供試藥劑： 5%氟吡菌酰胺(自配)，5%阿維菌素(自配)，2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺(自配)。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同藥劑對松材線蟲室內毒力測定 采用浸蟲法探究3種藥劑對松材線蟲的室內毒殺效果。用貝爾曼漏斗法收集培養在灰葡萄孢菌上的松材線蟲，3 500 r·min-1離心3min，沉淀經無菌水沖洗3次，配制成約為2 500條·mL-1線蟲液。用無菌水將3種供試藥劑分別稀釋為5個質量濃度梯度，每個質量濃度為1個處理，每個處理重復3次，以無菌水作為空白對照。將藥劑與蟲液體積比1∶9混合加入1.5 mL離心管中，將所有離心管置于 25℃恒溫培養箱中，24 h 后在顯微鏡下觀察并計算松材線蟲的存活與死亡數。將藥劑浸泡24 h的松材線蟲用無菌水沖洗3次，后置于無菌水中在25℃恒溫培養箱靜置24 h，觀察線蟲復蘇情況。

對照死亡率(%)=對照死亡數/對照供試蟲數×100；

校正死亡率(%)=(處理死亡率-對照死亡率)/

(1-對照組死亡率)×100。

由于線蟲存在假死現象，可對呈僵直、“C”形或“J”形的線蟲用昆蟲針反復刺激，若仍僵直不動，則可判定死亡(龍鼎新等， 2006)。

1.2.2 種群繁殖量的測定 將灰葡萄孢培養 5～7 天后，采用噴霧法用顯色噴霧器均勻噴施0.5 mL質量濃度為亞致死濃度LC20的藥劑，對照組加噴無菌水。每皿接入約400條松材線蟲，置于 25℃恒溫培養箱培養。待對照培養皿中的灰葡萄孢被吃完后即全部停止培養，采用貝爾曼漏斗法分離各皿中的松材線蟲，將蟲液定容至一定體積，搖勻后吸取 100μL 置于載玻片上，微微加熱至線蟲死亡，在顯微鏡下觀察并統計數量，計算不同處理中各個重復的線蟲總數。每種處理設3個重復。因氟吡菌酰胺是殺菌劑，再設一不接松材線蟲的對照組，加噴復配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺，觀察對灰葡萄孢抑菌效果。

1.2.3 松材線蟲卵的收集與測定 將培養在灰葡萄孢上的松材線蟲用貝爾曼漏斗法漏2 h，收集到15 mL離心管內，3 500 r·min-1離心3min，去上清。用無菌水清洗2～3遍，加無菌水配制成一定濃度的線蟲懸浮液。取適量松材線蟲懸浮液于3cm培養皿內，放到 25℃恒溫培養箱培養8～12 h，產生大量的松材線蟲卵粒并黏附在培養皿底部，將懸浮液連同松材線蟲一起輕輕倒掉，用無菌水沖洗 3～4 次，即可收集獲得松材線蟲卵粒。將培養得到的松材線蟲卵置于1.0、1.5、2、2.5和3.0 mg·L-15個不同質量濃度藥劑中，分別于24 h和48 h 后，用顯微鏡觀察并記錄卵的孵化情況，每個處理3次重復。

孵化率=(松材線蟲幼蟲數/

松材線蟲幼蟲與卵總數)×100。

1.2.4 卵形態觀察 藥劑處理24 h后，在光學顯微鏡下，用移液槍將藥劑浸漬下的松材線蟲卵挑出放置在載玻片上，滴水潤濕后加上蓋玻片，利用蔡司熒光顯微鏡觀察挑出的松材線蟲卵形態結構。

1.2.5 溫度梯度試驗 將復配藥劑用無菌水稀釋為1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg·L-15個質量濃度，置于溫度梯度培養箱中，在15、20、25、30、35℃條件下，24 h 后在顯微鏡下觀察并計算松材線蟲的存活與死亡數。

1.3 數據處理

采用 SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析，檢測其顯著差異性。用 Abbott 公式校正處理組死亡率。用 DPS 軟件和機率值分析法對藥劑進行毒力回歸分析，計算LC20值、LC50值及其95%置信限。

2 結果與分析

2.1 不同藥劑對松材線蟲毒力效果

不同藥劑在不同質量濃度下對松材線蟲的致死力見表1。3種藥劑中，復配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺的室內殺線效果最好，LC50值為2.020 8 mg·L-1，LC20值僅在0.447 9 mg·L-1; 其次是5%氟吡菌酰胺，LC50和LC20值分別是21.607 1和8.558 2 mg·L-1; 5%阿維菌素的殺線效果明顯較前2個藥劑弱，LC50和LC20濃度值分別達到51.153 6 和12.031 8 mg·L-1。

松材線蟲藥劑處理24 h后在無菌水中復蘇24 h結果見表2。2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺、5%阿維菌素、5%氟吡菌酰胺的LC50值分別為2.152 2、55.705 5和22.763 2 mg·L-1，與藥劑處理24 h結果相近(表2)。

表1 不同藥劑對松材線蟲毒力分析(24 h)

表2 松材線蟲復蘇24 h后LC50變化(48 h)

2.2 不同藥劑對松材線蟲繁殖取食影響

在藥劑處理6天后，對照組1中各培養皿中的灰葡萄孢均已被松材線蟲取食完，但藥劑處理組中還可看到灰葡萄孢(圖 1)，且單加噴復配藥劑未對灰葡萄孢產生影響(對照組2)。其中，5%氟吡菌酰胺處理組和復配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺處理組無明顯差異(P=0.31)，其余各組間的種群數量差異均達顯著水平(P<0.05)(圖2)。復配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺對松材線蟲種群數量的抑制作用最明顯，其次是5%氟吡菌酰胺，抑制效果相對最差的是5%阿維菌素，3種藥劑處理后的每皿松材線蟲種群數量分別為 (1 425±250)、(1 675±377) 和 (10925±504)條，而對照組線蟲數量均大于每皿20000條。

本試驗測定松材線蟲種群繁殖速率(pf/pi)，結果顯示，對照處理組具有較高繁殖速率(50.75)，5%阿維菌素處理組具有中等繁殖速率(27.31)，5%氟吡菌酰胺處理組和復配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺處理組繁殖速率較低，分別為4.19和3.56(圖2)。

圖1 不同藥劑處理6天后培養皿內灰葡萄孢被松材線蟲取食面積

圖2 不同藥劑亞致死濃度LC20處理對松材線蟲種群繁殖量和繁殖速率影響

2.3 不同藥劑對松材線蟲卵孵化率影響

不同藥劑在處理24 h和48 h后對松材線蟲卵孵化率的影響見圖3。在24 h時，松材線蟲在2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺0.5、1、1.5、2、2.5和3 mg·L-1共5個質量濃度的孵化率分別是73.37%、62.23%、42.19%、34.55%、20.32%；5%阿維菌素5個質量濃度處理時孵化率分別為83.22%、51.87%、39.62%、27.44%、21.36%； 在5%氟吡菌酰胺5個質量濃度處理時孵化率分別為52.58%、45.00%、36.42%、28.25%、22.89%，均遠低于對照組93.88%。48 h時，卵孵化率均上升，且質量濃度越低，上升越明顯。在質量濃度1 mg·L-1時，對松材線蟲卵孵化抑制效果5%氟吡菌酰胺>2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺>5%阿維菌素； 在質量濃度3 mg·L-1時，對松材線蟲卵孵化抑制效果為2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺>5%阿維菌素>5%氟吡菌酰胺。

在不同藥劑10 mg·L-1處理24 h后卵的形態變化見圖4，對照組松材線蟲卵基本已孵化為二齡幼蟲，藥劑處理組卵孵化率均較低。在10 mg·L-1時，復配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺處理組松材線蟲卵內形成多個液泡與空洞，卵死亡，其他2種藥劑處理組卵雖未孵化，但卵內未形成液泡，卵未死亡。

圖3 不同藥劑對松材線蟲卵孵化率的影響(24 h、48 h)

圖4 不同藥劑10 mg·L-1處理24 h后卵形態變化

2.4 不同溫度下2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺對松材線蟲致死效果

不同溫度條件下復配藥劑對松材線蟲致死效果見圖5，在15、20、25、30、35℃條件下復配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺的LC50分別為3.644 7、2.959 5、2.020 8、1.850 8、1.744 1 mg·L-1。同一質量濃度下，隨著溫度升高，松材線蟲的死亡率增加。

圖5 不同溫度下2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺對松材線蟲致死效果

3 討論

3.1 復配藥劑增效作用

阿維菌素為一種常用的松材線防治劑(談家金等， 2003； Sousaetal.， 2013)，它可以作為樹干注射劑來預防松材線蟲，單次注射持效期可達2年(Lietal.， 2016)。氟吡菌酰胺作為一種新型殺線藥劑對松材線蟲作用效果的研究較少，在2020年首次報道其對松材線蟲具有與阿維菌素類似的作用效果(Liuetal.， 2020)，筆者通過預試驗也證實了氟吡菌酰胺具有良好的殺線效果。將不同藥劑復配通常會對殺線活性具有增效作用(覃貴勇等， 2018)，將阿維菌素與氟吡菌酰胺復配對松材線蟲的生長繁殖影響還未有人研究，本研究發現復配藥劑2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺具有良好的殺線效果，其殺線活性遠高于氟吡菌酰胺和阿維菌素單一藥劑。

在室內殺線蟲試驗中，3種藥劑殺線效果以2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺>5%氟吡菌酰胺>5%阿維菌素，其致死中濃度(LC50)分別為2.0208、21.6071、51.1536 mg·L-1，本試驗測定出的各藥劑的致死濃度相較于前人的研究結果(Zhangetal.， 2017)略偏高，這可能與所用松材線蟲蟲株不同有關，本研究選用的試驗蟲株AMA3鑒定為1株強毒松材線蟲蟲株，該蟲株與我國不同地區收集蟲株相比，其繁殖力與致病力都更高(朱麗華等， 2017)，繁殖力強可能使得該蟲株對藥劑的抗性更強，從而使得致死中濃度偏高。氟吡菌酰胺具有良好的殺線效果，這與前人研究一致(Liuetal.， 2020)。本試驗表明，氟吡菌酰胺與阿維菌素的復配大大增強了殺線效果，具有良好的防治松材線蟲病的應用前景。

3.2 藥劑對松材線蟲繁殖產卵影響

在繁殖量試驗中，僅在亞致死濃度LC20條件下，3種藥劑就均對松材線蟲繁殖取食產生顯著影響，這證實了Bi等(2015)的研究成果，其中氟吡菌酰胺和復配藥劑抑制效果顯著，2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺在質量濃度0.447 9 mg·L-1質量下就嚴重抑制了松材線蟲的繁殖，阿維菌素對松材線蟲繁殖量抑制效果較差，這可能是因為阿維菌素的長期應用使得松材線蟲已產生抗藥性(Zhaoetal.， 2006； 周利娟等， 2011)的所致。

在松材線蟲卵孵化率試驗中，3種藥劑均能顯著抑制松材線蟲卵的孵化，這與前人研究一致(Liuetal.， 2020； Qietal.， 2006)，3種藥劑整體對卵孵化抑制效果相近，在質量濃度3 mg·L-1質量下，24 h后2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺處理組卵孵化率僅為20.32%，說明該復配藥劑在較低質量濃度下對松材線蟲卵孵化仍有良好的抑制效果。2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺處理后松材線蟲卵內形成液泡可能是因為高質量濃度藥劑破壞了卵細胞的滲透屏障，卵細胞破裂死亡，Rajasekharan等(2017)研究發現5-碘吲哚醌處理松材線蟲卵后也具有類似的作用。

3.3 溫度對松材線蟲抗藥性影響

溫度對松材線蟲的生長繁殖影響很大，松材線蟲的生長最適溫度為25℃，低于10℃則不能完成生長發育，大于28℃時繁殖被明顯抑制，大于33℃時不能繁殖(季英超等， 2021)，在不同溫度下，藥劑對松材線蟲的毒殺效果不同，筆者通過試驗發現隨著溫度的升高，2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺殺線效果增強，且在25℃之前，每增加5℃殺線活性提升更快，這可能是因為隨著溫度的升高，松材線蟲新陳代謝更旺盛，而低溫條件下松材線蟲會進入滯育狀態，脂肪相對積累率顯著上升(王博文等， 2017)，這使得松材線蟲對與藥劑處理的敏感性下降，存活率上升。

綜上所述，該復配藥劑可能具有良好的防治松材線蟲病的潛力，但2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺作為樹干注射處理防治松材線蟲的實際應用效果尚需進一步研究，如需要田間接種試驗觀察松樹存活情況、藥劑在樹體內持效期等。

4 結論

對比3種不同殺線藥劑的室內殺線效果、對松材線蟲繁殖量和卵孵化率等抑制作用發現，2%阿維菌素·6%氟吡菌酰胺作為一種新型復配殺線藥劑，對松材線蟲具有較強的抑制效果，溫度越高，殺線蟲效果越好。