52份辣椒主要果實性狀的遺傳多樣性及聚類分析

袁 雷，吉雪花，張國儒，石林媛，3，郭河瑤，唐亞萍，楊 濤，楊生保

（1.新疆農業科學院園藝作物研究所,烏魯木齊 830091；2.石河子大學農學院/特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子 832003；3.新疆農業職業技術學院，新疆昌吉 831100）

0 引言

【研究意義】辣椒（Capsicum annuumL.）屬于茄科，一年或多年生草本，同花或異花授粉，由于其果實豐富的營養及特有的辣味，種植不受地域限制[1]。辣椒果實中還含有辣椒素、VC、蛋白質、胡蘿卜素等豐富的營養成分。辣椒紅素是口紅和食品色素的天然原料來源；辣椒堿類物質廣泛應用于農作物害蟲防治[2-9]。近幾年我國辣椒種植面積穩定在210×104hm2以上，已超過大白菜等成為中國種植面積最大的蔬菜作物，其總產量達6 400×104多t[10]，新疆由于獨特的地理氣候條件，年種植面積可達6.67×104hm2（100 萬畝）左右，年產制干辣椒15×104～20×104t，辣椒相關制品品質優，已成為我國制干辣椒的重要產區之一[11，12]。新疆辣椒種質資源評價及資源整合效率低，進一步的種質資源評價及挖掘對新疆辣椒遺傳改良和種質創新具有重要意義。【前人研究進展】采用2種方法對辣椒種質進行遺傳多樣性和聚類研究。一是農藝性狀的統計分析，如通過統計分析辣椒種質的多個農藝性狀，分別對湖南、四川、新疆、貴州和湖北等地保存的辣椒種質資源進行了資源評價和分類，并從中篩選出多個品質好，具有較大研究和生產應用價值的辣椒新種質[13-17]。還有通過對國外引進辣椒種質資源的農藝性狀進行遺傳多樣性和聚類分析，發現辣椒種內和種間均存在豐富的遺傳變異[18-20]。二是分子標記技術，隨著生物技術的不斷發展，各種分子標記技術不斷成熟，利用不同類型分子標記技術對辣椒種質資源的分類和利用研究報道較多。如有利用RAPD分子標記技術分析了辣椒資源的遺傳多樣性[21，22]；有將SSR 標記技術應用于朝天椒、灌木椒和制干辣椒等辣椒種質資源的遺傳多樣性和聚類研究中[23-26]；有利用SNP 標記技術分別對來自不同國家的246 份、399 份和4652 份辣椒種質資源進行了種質資源評價及核心種質的挖掘工作[27-29]；還有利用RAPD和AELP、SRAP和SCoT及RAPD 和ISSR 等兩種分子標記相結合的方式對辣椒種質進行了遺傳多樣性分析[30-32]。【本研究切入點】對于辣椒種質資源的評價與分類，2種研究方法各有優勢且存在著不同作用。辣椒種質資源的評價分類是遺傳改良的基礎，果實是辣椒重要經濟產品。【擬解決的關鍵問題】研究重點針對49份新疆本地保存的高代自交辣椒種質和3份引進辣椒種質資源的13個主要果實性狀進行研究分析，其中對7個果實表型性狀和6個果實品質性狀分別采用常規實驗技術和高效液相進行調查，并利用變異分析、相關性分析、主成分分析和聚類分析等多種統計分析方法，對52份辣椒種質資源進行評價與分類。評價與分類保存的辣椒種質資源、為豐富辣椒種質資源，挖掘優異辣椒種質資源和品種改良提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

材料共52份，其中中國種辣椒（C.chinenseL，ZL-280）1 份；灌木椒（C.frutescens，LA-111）1 份；鳥辣椒（C.frutescensL，X-260）1 份；一年生辣椒（C.chinense）合計49 份，其中線椒8 份，螺絲椒6份，板椒35份，板椒按果形又細分為牛角椒10份和羊角椒25份，供試材料均由新疆農業科學院園藝所收集保存。表1

表1 52份辣椒種質材料信息Table 1 Information of 52 pepper germplasms

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

田間試驗于2019年3月開始，至2020年11月結束，分別在新疆和海南兩地開展。2019年3～9月和2020年3～9月在新疆農業科學院安寧渠良種繁育場進行第一、三個種植季，2019年10月～2020年3月在新疆農業科學院三亞南繁中心進行第二個種植季，試驗地肥力均中等，田間試驗均采取隨機區組設計，雙行種植，株距40 cm，溝心距1.5 m，每小區單獨種植一個品種，共計20 株，合計52個小區，并且全部采用膜下滴灌，栽培管理同大田[33]。

1.2.2 辣椒果實性狀

在每一季度果實成熟期，在每一小區內，隨機摘取辣椒4～6 節位的10個紅熟果實。根據李錫香等[34]出版的《辣椒種質資源描述規范和數據標準》用游標卡尺、細線、直尺等工具對果實類型、果實縱徑、果實橫徑、果梗長度等8個性狀進行統計。

1.2.3 辣椒果實品質

對隨機摘取的成熟度一致果實，經自然晾干、破碎和過篩等步驟后，將辣椒粉末封裝保存，用于后續色價、辣椒素、辣椒紅素等辣椒主要果實品質的測定。

1.2.3.1 辣椒色價

稱取0.02 g 破碎處理過的辣椒粉末至10 ml離心管中，每個樣品設置3個重復。然后向每管中加入5 mL丙酮，并放置在超聲波清洗器內超聲30 min。超聲處理結束后離心5 min（轉速不低于4 000 r/min）。吸取約2 mL的上層提取液，用丙酮定容至5 mL，再用分光光度計在460 nm 波長處，于1 cm 比色皿中測定稀釋后提取液的吸光度值。計算色價：

式中A為實測標樣的吸光度；f 為稀釋倍數；m為樣品質量，單位為g。

1.2.3.2 辣椒素類物質

辣椒素類物質的測定使用甲醇溶劑作為萃取劑，后使用高效液相色譜儀測定。稱取0.5000 g的辣椒粉末至10 mL離心管中，后向管中加入5 mL 甲醇。然后放置在超聲波清洗器中超聲30 min，結束后在4 000 r/min下離心5 min，并將上清液轉移至10 ml 容量瓶中。在濾渣中重新加入5 mL 甲醇，超聲和離心結束后將2 次上清液合并，用甲醇定容至10 mL。將定容后的提取液倒入燒杯中，用帶有0.22μm 有機濾膜的一次性注射器過濾后用于色譜分析。色譜柱采用SymmetryORC18（5μm，4.6 mm×250 mm）；流動相為7：3的甲醇與超純水；流速為1.0 mL/min；檢測波長為280 nm；進樣量為5μL；柱溫為35 ℃。

1.2.3.3 辣椒紅素

稱取0.200 0 g 的辣椒粉末至10 mL 離心管中，向管中加3 mL 丙酮，超聲25 min，然后在3500 r/min 下離心5 min，再將上清液移至10 mL容量瓶。再依次向濾渣中加入3、4 mL丙酮，重復上述操作，并將3 次上清液合并后用丙酮定容至10 ml。將上清液倒入燒杯中，用帶有0.45μm 有機濾膜的一次性注射器過濾后用于色譜分析。色譜柱采用waters-3（5μm，4.6 mm×250 mm）；流動相為甲醇和二氯甲烷（25：75）；流速為1 ml/min；進樣量為5μL；色譜檢測波長為474 nm；柱溫為30 ℃。

辣椒類物質和辣椒紅素均需要用標準樣品繪制標準曲線，計算回歸公式，從而將吸光度換算為含量值，總辣椒素類物質含量和辣度均采用GB/T 21266-2007 計算得到[35]。

1.3 數據處理

數據均采用Microsoft Excel 2019 和SPSS 25.0 進行統計分析，圖形使用R 和Origin 2018 制作。果實表型性狀的分級采用陳雪燕等[36]描述的分級方法，根據數據的平均值（M）和標準差（S）將數據分為10 級，第一級為Xi ＜（M- 2S）、第二級為（M- 2S）≤Xi ＜（M- 1.5S）、第三級為（M-1.5S）≤Xi ＜（M-S）、以此類推，每0.5 S 為1 級直至第10 級Xi ≥（M+2S），計算果實表型性狀的頻率分布。

2 結果與分析

2.1 52份辣椒種質遺傳多樣性

研究表明，13個指標的變異系數均值為58.19%，果實表型性狀變異系數普遍較小，而果實品質性狀變異系數普遍較大。

7個果實性狀的平均變異系數29.38%。以變異系數從大到小排序，單果重（50.42%）＞胎座大小（39.36%）＞果實橫徑（30.54%）＞果實縱徑（29.78%）＞果肉厚（21.58%）＞果梗長度（20.80%）＞心室數（13.15%）。其中單果重的變異幅度（60.92）和變異系數（50.42%）均最高，在此52 份辣椒種質中單果重存在豐富的遺傳變異。

以變異系數的從大到小排序，辣椒素含量（143.15%）＞總辣椒素類物質含量（122.66%）＞二氫辣椒素含量（104.52%）＞辣度（102.54%）＞辣椒紅素含量（43.61%）＞色價（34.38%）。其中辣椒素含量、二氫辣椒素含量、總辣椒素類物質含量和辣椒紅素含量變異系數均在100%以上，52 份辣椒素種質中這4個指標的遺傳多樣性最為豐富，而辣椒紅素含量和色價變異系數均低于50%，這2個指標在該份辣椒種質資源中豐富性不高。魔鬼椒（ZL-280）的辣椒素含量（35.54 g/kg）、二氫辣椒素含量（12.39 g/kg）、總辣椒素類物質含量（53.25 g/kg）和辣度（3134）均最高，但辣椒紅素含量最低，僅為2.55 mg/kg。辣椒紅素和辣素呈反相關。

7個性狀均屬于正態分布。其中果梗長度、胎座大小、單果重均在5級附近達到高峰，果實橫徑、果實縱徑、果肉厚以及心室數均在7級附近出現高峰。7個性狀的分布頻率出現高峰時等級不一致，但每一等級的分布頻率十分接近，7個指標相關性較強。表2，圖1

表2 52份辣椒種質果實性狀遺傳變異Table 2 Genetic variation analysis of fruit characters in 52 pepper germplasms

圖1 辣椒果實性狀頻率分布Fig.1 Frequency distribution of pepper fruit characters

2.2 辣椒果實性狀相關性

研究表明，13個性狀之間存在著不同程度的極顯著或顯著正負相關，相關系數介于-0.61 ～1。果實縱徑與果梗長度呈極顯著正相關，相關系數為0.46。果實橫徑與胎座大小呈極顯著正相關，相關系數為0.93。果肉厚與果實橫徑、胎座大小呈極顯著正相關，與果實縱徑、果梗長度呈顯著正相關，相關系數介于0.32 ～0.70。心室數與果實橫徑、胎座大小極顯著正相關，與果肉厚顯著正相關，相關系數分別為0.49、0.42、0.29。單果重與果實縱徑、果實橫徑、胎座大小、果肉厚和心室數均呈極顯著正相關，相關系數介于0.40 ～0.88。色價與果實縱、橫徑和辣椒紅素均顯著正相關，相關系數為0.29、0.30、0.26。辣椒素類物質含量與果實縱徑均顯著負相關，與色價均極顯著負相關，相關性系數介于-0.39 ～-0.13。辣度與果實縱、橫徑等7個性狀極顯著負相關，相關性系數介于-0.61 ～-0.28，辣度又與辣椒素類物質含量呈極顯著正相關，相關性系數介于0.660 ～0.675。圖2

圖2 13個辣椒果實指標的相關性Fig.2 Correlation analysis of 13 pepper fruit indexes

2.3 辣椒果實性狀的主成分

研究表明，提取了特征值大于1 的4個主成分，其貢獻率分別為38.39%、23.33%、11.30%、8.52%，累積貢獻率為81.54%，已足以代表全部指標的大部分信息。

第一主成分的特征值為4.990，其貢獻率最高，為38.39%。其中單果重載荷值最大，為0.785，果實橫徑、胎座大小載荷較高且為正值，載荷值分別為0.716 和0.667，主要反映果實重量。載荷較高且為負值的性狀有辣椒紅素含量、辣椒素含量、二氫辣椒素含量和總辣椒素含量，載荷值介于-0.852～-0.706。第二主成分的特征值為3.033，貢獻率為23.33%。其中二氫辣椒素最高為0.654，辣椒素、總辣椒素等載荷均較高且為正值，主要反映果實辣度。第三主成分的特征值為1.469，貢獻率為11.30%。其中果梗長和果實縱徑載荷值較高，分別為0.876、0.637，主要反映果實長度，其余載荷值均較小。第四主成分的特征值為1.107，貢獻率為8.52%。其中辣椒紅素載荷值最大，為0.851，主要反映果實中辣椒紅素含量。表3

表3 13個辣椒果實指標的主成分Table 3 Principal component analysis of 13 pepper fruit indexes

2.4 聚類分析

研究表明，在歐式距離5.0處，可以將這52份辣椒材料分為四個類群。第一類群只含有1份材料，為魔鬼椒，色價為3.57，總辣椒素類物質含量為53.25g/kg，該材料的獨特性。第二類群包含2份材料，分別為鳥椒和灌木椒，平均色價為3.55，平均總辣椒素類物質含量為4.12 g/kg，該類群資源色價最低，但總辣椒素含量較高。第三類材料包含11 份材料，主要為一年生栽培辣椒種，其在閾值2.5 處，又可分為兩個亞群，第一亞群ⅢA 含有6份材料，包含1份線椒、2份羊角椒和3份牛角椒，平均色價為20.98，平均總辣椒素類物質含量為0.67g/kg；第二亞群ⅢB 包含5 份材料，且全為羊角椒，平均色價為24.89，平均總辣椒素類物質含量為0.55g/kg。第三類群資源色價最高，但總辣椒素含量最低，第二亞群ⅢB 與第一亞群ⅢA相比，其色價更高，總辣素含量相對較低。第四類材料涵蓋的種質資源最為豐富，共包含38份材料，平均色價為13.94，平均總辣椒素類物質含量為3.13 g/kg，該類群資源色價和總辣椒素含量均較高，當閾值為2.5 時，可分為三個亞群，第一亞群ⅣA共18份種質材料，共包含10份羊角椒，6份牛角椒，2 份線椒；第二亞群ⅣB 所含種質資源最為豐富，共19 份材料，其中6 份羊角椒，6 份螺絲椒，5份線椒，2份牛角椒；第三亞群ⅣC僅有一份材料，為羊角椒（GB-35），其色價為13.63，總辣椒素含量僅低于魔鬼椒為7.31，該份種質資源較為獨特。圖3

圖3 52份辣椒種質資源聚類Fig.3 Cluster analysis of 52 pepper germplasm resources

3 討論

3.1 辣椒種質資源遺傳多樣性評價

種質資源是作物遺傳育種的重要基礎，而種質資源的遺傳多樣性是評價種質資源是否豐富的重要指標，種質資源越豐富[37]。目前，采用形態學性狀進行辣椒種質資源遺傳多樣性的研究很多，并且均取得了不錯的研究成果[13，15-17，20]。分子標記技術利用基因進行遺傳多樣性研究，研究結果更為穩定和可靠，利用分子標記輔助育種技術的研究日益增多[21-32]。并且形態學標記性狀易獲得，且簡單、直接[38，39]。52份辣椒種質資源的13個主要果實性狀平均變異系數為58.19%，遺傳多樣性較為豐富，與前人研究結果相似[19]。研究中果實縱徑、果實橫徑和果梗長度等7個主要果實表型性狀的變異系數均值僅為29.38%，這52 份辣椒種質在果實表型方面種質資源類型不夠豐富，而色價、辣椒紅素含量、辣椒素含量等6個果實品質性狀的變異系數均值高達91.81%，這52 份辣椒種質在果實品質方面具有豐富的遺傳多樣性。

3.2 各性狀相關性與聚類分析

相關性分析是能夠反映變量間關聯密切程度的一種統計方法，目前也已廣泛應用于辣椒研究中[14，15，20]。研究通過SPSS 25.0軟件進行相關性分析表明，果實橫徑、胎座大小、果肉厚、心室數以及單果重兩兩之間均存在顯著正相關；色價與辣椒素類物質含量和辣度之間呈極顯著負相關；辣椒素類物質含量和辣度之間均呈極顯著正相關，研究結果與前人相似[14，20]。

聚類分析是種質資源分類研究常用的一種統計方法，其在辣椒種質資源研究中也已被廣泛應用[14-19，23-26，31]。研究主成分分析表明，單果重、果實大小、辣度及辣椒紅素含量是辣椒果實的4個主要因子；52辣椒種質在果實品質方面遺傳差異較大；并且在辣椒中，色價和辣度常作為辣椒品質的重要評判性狀[14]。將52份辣椒種質分為4大類，并成功將魔鬼椒、鳥椒和灌木椒這3份特殊材料與一年生辣椒栽培種區分開來，與前人研究結果部分相似[16]。四大類群中，第三類群平均色價最高，其中又以第二亞群ⅢB 平均色價最高，達24.89，且全為羊角椒，可用于后期高色價制干辣椒的育種和色素研究中。在第四類材料中，GB-35被單獨分離出來，其色價為13.63，總辣椒素含量為7.31 g/kg，可作為高色價、高辣素的遺傳育種材料。

4 結論

52 份辣椒種質資源13個主要果實性狀均存在不同程度的變異，變異系數介于13.15%～143.15%，變異系數均值為58.19%，這52 份辣椒種質資源遺傳多樣性比較豐富。其中果實品質相關性狀遺傳多樣性最為豐富，變異系數均值達91.81%。在歐式距離7.5處，可將灌木椒、鳥椒和魔鬼椒與一年生辣椒區分開來；在歐式距離5.0處，可將52 份辣椒種質分為四大類，其中第三類群第二亞群ⅢB 的5 份羊角椒材料色價最高，第四類材料中存在一份高色價、高辣素的特殊材料，均可用于后期辣椒果實品質的品種改良。