外周血單個核細胞TLR2 mRNA和TLR4 mRNA對泌尿系結石患者術后并發尿源性膿毒血癥的診斷效能

王瑞，郝井志，劉曉琳

1.延安大學咸陽醫院檢驗科，陜西 咸陽 712000；2.延安大學咸陽醫院腦血管病研究所，陜西 咸陽 712000

尿源性膿毒血癥是泌尿系結石術后嚴重并發癥[1-2]。據報道，經皮腎鏡術后尿源性膿毒血癥發生率女性為10.9%，男性為1.4%，且其病死率高達30.0%～40.0%，若未予以及時有效干預，隨病情發展可演變為感染性休克，威脅患者生命安全[3-4]。因此，早期篩查與預防尤為必要。目前臨床診斷尿源性膿毒血癥主要通過體溫變化、心律失常、血常規等，雖具有一定預防指導意義，但其無法明確病情發展程度，不利于實施個性化治療方案[5]。近年來，相關研究認為，尿源性膿毒血癥是一個復雜、多階段且動態的綜合征癥狀，其病理機制涉及復雜的全身炎癥網絡效應、免疫功能障礙、組織損傷及宿主對感染的反應等諸多方面[6-8]。外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)主要包括淋巴細胞和單核細胞等，是機體抵抗感染的重要免疫細胞類型。而Toll樣受體(toll like receptors，TLRs)不僅是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質分子，也是連接非特異性免疫、特異性免疫的橋梁，是機體抗感染與損傷的第一道防線，表達于PBMCs表面，發生感染時TLR2 mRNA、TLR4 mRNA可迅速被激活，并能調控PBMCs對感染的應答過程，在免疫性炎癥疾病中起著重要作用，因此推測PBMCs表面TLR2 mRNA、TLR4 mRNA與泌尿系結石患者術后并發尿源性膿毒血癥有關，但現階段關于這方面的研究鮮見[9]。為此，本研究嘗試探討外周血單個核細胞TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表達與泌尿系結石患者術后并發尿源性膿毒血癥的關系，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年1月至2021年4月延安大學咸陽醫院收治的59例泌尿系結石術后并發尿源性膿毒血癥患者(觀察組)、59例泌尿系結石術后單純泌尿系感染患者(對照B組)、59例泌尿系結石術后無泌尿系感染患者(對照A組)進行前瞻性研究。觀察組患者中普通尿源性膿毒血癥26例、嚴重尿源性膿毒血癥22例和感染性休克11例。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準

1.2 .1 單純泌尿系感染診斷標準[10]泌尿系結石術后，尿常規檢查見大量的白細胞甚至膿球，尿液細菌培養檢出細菌菌株。

1.2 .2 尿源性膿毒血癥的診斷標準(1)泌尿系結石術后，尿常規檢查見大量的白細胞甚至膿球，尿液細菌培養檢出細菌菌株。(2)滿足以下≥2項：A，心率＞各年齡組正常平均值2個標準差；B，體溫＜36℃或＞38℃；C，呼吸頻率＞各年齡組正常平均值2個標準差或需機械通氣；D，血白細胞＞12×109/L或＜4×109/L，或桿狀核細胞＞10%，且出現威脅生命的器官功能障礙，如意識改變、呼吸頻率≥22次/min、收縮壓≤100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)等。

1.2 .3 尿源性膿毒血癥病情評估(1)普通尿源性膿毒血癥：①泌尿系結石術后，尿常規檢查見大量的白細胞甚至膿球，尿液細菌培養檢出細菌菌株。②滿足以下≥2項：A，心率＞各年齡組正常平均值2個標準差；B，體溫＜36℃或＞38℃；C，呼吸頻率＞各年齡組正常平均值2個標準差或需機械通氣；D，血白細胞＞12×109/L或＜4×109/L，或桿狀核細胞＞10%，且出現威脅生命的器官功能障礙，如意識改變、呼吸頻率≥22次/min、收縮壓≤100 mmHg等。(2)嚴重尿源性膿毒血癥：在普通尿源性膿毒血癥基礎上，出現急性器官功能衰竭(滿足至少1項)：①腦(精神癥狀)，煩躁、嗜睡、昏迷、意識混亂；②血小板＜80 000/μL或3 d內降低＞50%；③心臟、循環系統，平均動脈壓≤70 mmHg或動脈收縮壓≤90 mmHg；④代謝酸中毒，剩余堿≥5 mmol/L或血pH≤7.30或血乳酸根≥正常1.5倍；⑤肺，氧化指數≤250或動脈氧分壓≤75 mmHg；⑥腎，尿量＜0.5 mL/(kg·h)。(3)感染性休克：在嚴重尿源性膿毒血癥基礎上，需血管活性藥物維持收縮壓＞90 mmHg或平均動脈壓＞65 mmHg或收縮壓≤90 mmHg至少1 h，出現補充容量不能糾正的低血壓[11]。

1.3 納排標準(1)納入標準：①各組符合以上對應的尿源性膿毒血癥、單純泌尿系感染診斷標準；②對照A組為泌尿系結石術后無泌尿系感染患者；③均符合泌尿系結石術指征。(2)排除標準：①入院前近7 d內有抗菌藥物治療史者；②泌尿系結石術前明確感染者；③阿爾茨海默癥、老年癡呆或精神行為異常者；④其余慢性疾病或惡性疾病者。

1.4 檢測方法

1.4 .1 主要試劑儀器降鈣素原(procalcitonin，PCT)試劑盒購自上海透景生命科技股份有限公司；C-反應蛋白(C-reactionprotein，CRP)試劑盒購自北京森美希克瑪生物科技有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；PCR試劑盒(美國Invitrogen公司)；全自動免疫發光儀(雅培i2000)；血細胞分析儀(美國貝克曼-庫爾特公司的HMX型)；實時熒光PCR儀(美國ABI公司PE-7900HT型)。

1.4 .2 經典炎癥標志物檢測于確診后(術后3 d內)取9 mL肘靜脈血，采用血細胞分析儀測定白細胞(white blood cell，WBC)；采用化學發光免疫法檢測血清PCT水平，采用免疫比濁法檢測血清CRP水平。

1.4 .3 TLR2 mRNA、TLR4 mRNA檢測取上述所采集的血標本2 mL，采用密度梯度離心法分離人PBMCs，加入2 mL Hank’s液混勻，沿食管壁緩慢加入到2 mL分離液中，2 000 r/min離心20 min，小心吸取灰白色層的單個核細胞，置于另一離心管中，用5倍體積的Hank’s液將所獲得的PBMCs懸液洗滌2次，1 500 r/min離心5 min，計數細胞，調整為5×109個/L。Trizol提取總RNA，逆轉錄后，取逆轉錄產物實施聚合酶鏈反應(PCR)擴增。各基因引物序列及其產物見表1。混合物充分混勻后，置于PCR儀中擴增，反應條件依次為：TLR2，95℃變性5 min，95℃30 s，退火60℃30 s，72℃30 s，循環35次，72℃延伸10 min；TLR4，95℃變性5 min，95℃30 s，退火50℃30 s，72℃30 s，循環30次，72℃延伸10 min。實施瓊脂糖凝膠電泳、上樣，凝膠成像，采用凝膠圖像分析軟件定量，TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表達量以相對內參表示，見表1。

表1 各基因引物序列及其產物

1.5 統計學方法應用SPSS22.0統計學軟件分析數據。計數資料以例數描述，采用χ2檢驗；計量資料符合正態分布，以均數±標準差(±s)描述，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩組間比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；TLR2 mRNA、TLR4 mRNA與經典炎癥標志物的相關性采用Spearman分析；并發尿源性膿毒血癥的相關影響因素采用多因素Logistic回歸分析；TLR2 mRNA、TLR4 mRNA對尿源性膿毒血癥的診斷價值采用受試者工作特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線，獲取曲線下面積(AUC)、置信區間、敏感度、特異度及Cut-off值。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組患者的一般資料比較三組患者年齡、性別、體質量指數、手術方式、結石類型比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 三組患者的一般資料比較[±s，例(%)]

表2 三組患者的一般資料比較[±s，例(%)]

觀察指標年齡(歲)性別(男/女)體質量指數(kg/m2)手術方式經皮腎鏡取石輸尿管軟鏡鈥激光碎石輸尿管鏡下氣壓彈道碎石結石類型腎結石尿路結石觀察組(n=59)59.77±6.03 35(59.32)/24(40.68)22.37±1.98 24(40.68)23(38.98)12(20.34)28(47.46)31(52.54)對照B組(n=59)60.08±5.86 38(64.41)/21(35.59)22.42±2.04 23(38.98)26(44.07)10(16.95)27(45.76)32(54.24)對照A組(n=59)59.83±5.95 34(57.63)/25(42.37)22.35±1.92 27(45.76)21(35.59)11(18.64)30(50.85)29(49.15)F/χ2值0.045 0.614 0.020 1.076 0.317 P值0.956 0.736 0.981 0.898 0.854

2.2三組患者的血清PCT、CRP、WBC和TLR2 mRNA、TLR4 mRNA比較觀察組患者的PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA明顯高于對照B組、對照A組，且對照B組患者的PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA明顯高于對照A組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 三組患者的血清PCT、CRP、WBC和TLR2 mRNA、TLR4 mRNA比較(±s)

表3 三組患者的血清PCT、CRP、WBC和TLR2 mRNA、TLR4 mRNA比較(±s)

注：與觀察組比較，aP＜0.05；與對照B組比較，bP＜0.05。

觀察指標PCT(μg/L)CRP(mg/L)WBC(×109/L)TLR2 mRNA TLR4 mRNA觀察組(n=59)5.89±1.15 35.59±5.62 14.35±3.52 5.68±1.24 3.94±1.01對照B組(n=59)0.61±0.13a 12.45±3.78a 12.94±1.87a 2.34±0.50a 1.26±0.33a對照A組(n=59)0.14±0.05ab 7.25±2.16ab 8.62±1.33ab 1.06±0.15ab 0.97±0.18ab F/χ2值1 344.566 797.153 89.360 556.369 408.626 P值0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

2.3 觀察組不同病情患者的一般資料比較觀察組不同病情患者的年齡、性別、體質量指數、手術方式、結石類型比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表4。

表4 觀察組不同病情患者的一般資料比較[±s，例(%)]

表4 觀察組不同病情患者的一般資料比較[±s，例(%)]

觀察指標年齡(歲)男/女體質量指數(kg/m2)手術方式經皮腎鏡取石輸尿管軟鏡鈥激光碎石輸尿管鏡下氣壓彈道碎石結石類型腎結石尿路結石普通尿源性膿毒血癥(n=26)59.43±8.19 16(61.54)/10(38.46)22.45±2.20 10(38.46)9(34.62)7(26.92)11(42.31)15(57.69)嚴重尿源性膿毒血癥(n=22)60.26±9.37 11(50.00)/11(50.00)22.29±2.13 9(40.91)8(36.36)5(22.73)10(45.45)12(54.55)感染性休克(n=11)59.59±10.01 8(72.73)/3(27.27)22.34±2.05 5(45.45)6(54.55)0 7(63.64)4(36.36)F/χ2值0.054 1.664 0.034 3.796 1.467 P值0.948 0.435 0.966 0.434 0.480

2.4 TLR2 mRNA、TLR4 mRNA與經典炎癥標志物的相關性經Spearman分析結果顯示，TLR2 mRNA與PCT(r=0.906)、CRP(r=0.900)、WBC(r=0.897)呈 正 相 關(P＜0.05)，TLR4 mRNA與PCT(r=0.873)、CRP(r=0.933)、WBC(r=0.916)呈正相關(P＜0.05)，見圖1。

圖1 TLR2、TLR4 mRNA與經典炎癥標志物的相關性

2.5 泌尿系結石術后并發尿源性膿毒血癥的影響因素經多因素Logistic回歸分析結果顯示，PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA均是并發尿源性膿毒血癥的相關影響因素(P＜0.05)，見表5。

表5 泌尿系結石術后并發尿源性膿毒血癥影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.6 TLR2 mRNA、TLR4 mRNA診斷尿源性膿毒血癥的效能經ROC分析結果顯示，TLR2 mRNA診斷并發尿源性膿毒血癥的AUC為0.829(95% CI：0.748～0.892)，高于PCT、CRP、WBC的AUC(Z=4.188，P=0.000；Z=2.696，P=0.034；Z=4.592，P=0.000)；TLR4 mRNA診斷并發尿源性膿毒血癥的AUC為0.838(95% CI：0.759～0.900)，高于PCT、CRP、WBC的AUC(Z=4.054，P=0.000；Z=2.436，P=0.045；Z=4.530，P=0.000)，見圖2、表6。

表6 各指標診斷尿源性膿毒血癥的效能

圖2 各指標診斷尿源性膿毒血癥的ROC

2.7 觀察組不同病情患者PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表達比較感染性休克患者PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA高于嚴重尿源性膿毒血癥患者、普通尿源性膿毒血癥患者，差異有統計學意義(P＜0.05)；嚴重尿源性膿毒血癥患者PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA高于普通尿源性膿毒血癥患者，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表7。

表7 不同病情患者PCT、CRP、WBC、TLR2、TLR4 mRNA表達比較(±s)

表7 不同病情患者PCT、CRP、WBC、TLR2、TLR4 mRNA表達比較(±s)

注：與普通尿源性膿毒血癥比較，aP＜0.05；與嚴重尿源性膿毒血癥比較，bP＜0.05。

觀察指標PCT(μg/L)CRP(mg/L)WBC(×109/L)TLR2 mRNA TLR4 mRNA普通尿源性膿毒血癥(n=26)3.64±1.03 25.14±4.84 12.01±2.76 3.59±1.03 2.11±0.98嚴重尿源性膿毒血癥(n=22)6.15±1.22 38.22±8.64 14.82±3.25 3.59±1.03 4.26±1.05a感染性休克(n=11)10.69±1.35 55.03±11.82 18.94±4.38 10.46±1.57ab 7.63±1.15ab F值142.407 56.376 17.566 127.111 110.865 P值0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

3 討論

目前臨床檢測泌尿系結石術后并發尿源性膿毒血癥指標較多，如經典炎癥標志物中的PCT、CRP、WBC等，但上述指標檢測敏感度、特異度差異較大，且對年齡較大患者，發生嚴重感染時WBC降低和升高表現不一，可能影響后續治療[12]。因此，積極探索泌尿系結石術后并發尿源性膿毒血癥檢測的新指標是目前臨床亟需解決的難點與重點。

Toll樣受體是固有免疫系統中的重要模式識別受體，可對病原相關分子模式(PAMPs)與損傷相關分子模式(DAMPs)做出反應，從而成為機體抗感染與損傷的第一道防線[13-14]。TLR2作為病原微生物的PAMPs識別受體，可識別多聚糖，能快速啟動致病因子信號轉導過程，釋放大量炎性介質，進而在抗感染免疫中發揮重要生物學作用[15-16]。同時，相關研究顯示，TLR4可識別脂多糖，激發機體炎性反應，參與免疫炎性疾病發展進程[17-18]。本研究數據表明，泌尿系結石術后并發尿源性膿毒血癥患者TLR2 mRNA、TLR4 mRNA高于單純泌尿系感染患者、無泌尿系感染患者，提示TLR2 mRNA、TLR4 mRNA與并發尿源性膿毒血癥有關。韓冬等[19]報道，膿毒癥患者TLR2表達升高，本研究結論與之存在相似之處。泌尿系結石術后并發尿源性膿毒血癥導致病原微生物大量增殖與入侵，引發機體抵抗力下降，產生大量內毒素，活化單核細胞、巨噬細胞及中性粒細胞等，生成大量白細胞介素1、腫瘤壞死因子-α等前炎性反應細胞因子，最終啟動適應性免疫，誘發炎性反應瀑布鏈，主要表現為TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表達上調[20]。

另外，CRP、PCT、WBC是炎性標記物，可釋放多種炎癥細胞因子，加重炎癥反應[21-23]。本研究結果發現，觀察組PCT、CRP、WBC高于對照B組、對照A組，是并發尿源性膿毒血癥的相關影響因素。ROC分析顯示，PCT、CRP、WBC對并發尿源性膿毒血癥具有一定評估價值。且本研究經Spearman相關性分析創新性發現，TLR2 mRNA、TLR4 mRNA與PCT、CRP、WBC均存在正相關性，提示TLR2 mRNA、TLR4 mRNA可作為炎癥標志物，可能有助于評估泌尿系結石術后并發尿源性膿毒血癥。由于革蘭氏陰性菌是尿源性膿毒血癥形成的主要致病菌，而革蘭氏陰性菌細胞壁毒性成份LPS通過結合脂多糖結合蛋白(LBP)、細胞表面可溶性分化抗原簇14(CD14)，可形成LPS-LBP-CD14復合物，進而激活TLR4通路，并通過下游髓樣分化蛋白88(MyD88)依賴途徑與非MyD88依賴途徑，活化核因子κB(NF-κB)信號傳導通路，釋放大量炎性因子，從而加重機體炎癥反應，引發炎癥級聯反應[24-26]。由此可見，TLR2 mRNA、TLR4 mRNA可能是通過調節泌尿系結石術后并發尿源性膿毒血癥患者體內炎癥反應，在疾病發展中起促進作用。在以上研究基礎上，本研究通過繪制ROC曲線還發現，TLR2 mRNA診斷并發尿源性膿毒血癥的AUC高于PCT、CRP、WBC的AUC，提示TLR2 mRNA、TLR4 mRNA對泌尿系結石術后并發尿源性膿毒血癥診斷價值高于常規炎癥標志物，提示早期檢測外周血單個核細胞TLR2 mRNA、TLR4 mRNA，有望為臨床診斷泌尿系結石術后并發尿源性膿毒血癥提供有效輔助手段。

此外，本研究數據還表明，TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表達越高，患者病情越嚴重，結合王玉潯等[27]、陳歐等[28]研究分析機制可能與TLR2 mRNA、TLR4 mRNA介導生成腫瘤壞死因子-α、白細胞介素1等促炎介質，反過來進一步上調TLRs基因表達蛋白合成，進而形成正反饋，不斷放大炎癥反應，致使炎癥反應失調，最終引起感染性休克發生有關。推測抑制TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表達可能是阻斷泌尿系結石術后并發尿源性膿毒血癥病情進展的重要原因，但具體機制仍需今后進一步論證，這也是今后的一個研究方向。

綜上所述，泌尿系結石術后并發尿源性膿毒血癥患者存在TLR2 mRNA、TLR4 mRNA升高現象，早期檢測上述指標可為臨床診斷、病情程度評估提供循證指導。