阿魏酸調(diào)控心肌肥厚的作用機制

吳 波，張伶俐，陳 醒，王玥坤，魏 瑋，高 茗，藍(lán)曉紅

(中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 藥劑科，江蘇 南京 210002)

心肌肥厚(Cardiac hypertrophy)是由高血壓、心律失常等多種因素引起的心臟組織結(jié)構(gòu)異常病變，臨床表現(xiàn)為心臟體積擴大，冠狀動脈血流減少，導(dǎo)致心功能下降，最終引起左心室肥厚。如未及時有效給予干預(yù)，最終會導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的心力衰竭[1-2]。目前，臨床上還未有關(guān)于心肌肥厚相關(guān)的特效藥上市，大多數(shù)學(xué)者將研究重心放在干預(yù)心肌肥厚的發(fā)展過程上。阿魏酸(Ferulic acid，F(xiàn)A)是自然界普遍存在的一種酚酸，具有抗氧化、抗菌消炎、抗血栓、降血脂、降低心肌耗氧量、保護(hù)婦女卵巢和降低肝損傷等藥理作用[3-4]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、化妝品及食品添加劑中。然而，阿魏酸是否具備干預(yù)心肌肥厚的作用鮮有報道。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(Network pharmacology)基于大數(shù)據(jù)平臺，通過挖掘靶點數(shù)據(jù)間的差異，闡明“靶點-靶點”間的相互作用關(guān)系，被廣泛應(yīng)用于藥物機理研究[5]。分子對接技術(shù)(Molecular Docking)作為計算機輔助藥物設(shè)計的一種主要方法，目前已被廣泛用于新型藥物研發(fā)的各個環(huán)節(jié)[6]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)挖掘阿魏酸作用于心肌肥厚的相關(guān)靶點，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行GO和KEGG分析，并對核心靶點進(jìn)行分子對接驗證，以闡明阿魏酸調(diào)控心肌肥厚的相關(guān)機制。本研究技術(shù)路線，見圖1。

圖1 技術(shù)路線

1 材料與方法

1.1 阿魏酸的預(yù)測靶點

在臺灣中醫(yī)藥資料庫(http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/chemical.php)搜索“ferulic acid”，得到關(guān)于阿魏酸的相關(guān)信息，選擇格式為*.mol2保存。將ferulic acid.mol2文件上傳到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http：//swisstargetprediction.ch/)，選擇種屬為“Homo sapiens”。

1.2 心肌肥厚的相關(guān)靶點

在基因序列Gene Card(https：//auth.lifemapsc.com/)平臺上搜索“Cardiac hypertrophy”，選擇種屬為“Homo sapiens”，選擇“Relevance score”排名前2 000的基因靶點；在開放靶點平臺Open Targets(https：//platform.opentargets.org/)上搜索“Cardiac hypertrophy ”，選擇種屬為“Homo sapiens”，篩選“over all Association Score”排名前2 000的靶點基因。將上述平臺獲得的靶點基因進(jìn)行韋恩圖分析，篩選出共同基因靶點[7]。

1.3 構(gòu)建蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)及核心基因Hub篩選

將得到的共同靶點基因上傳到STRIN平臺(https：//string-db.org/)，選擇“Multiple proteins”，organism選擇“Homo sapiens”，其他參數(shù)保存默認(rèn)，得到蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將string_interactions_short.tsv導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，用APP中“MCODE”插件進(jìn)行Hub基因篩選，按Score進(jìn)行排序。

1.4 通過David數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG信號通路富集

將“1.2”項得到的共同基因靶點上傳到David數(shù)據(jù)平臺(https：//david.ncifcrf.gov/)，選擇“Office Gene symbol”，物種選擇“Homo sapiens”，進(jìn)行基因本體(GO)和京都基因百科全書KEGG信號通路富集。

1.5 阿魏酸與核心蛋白的分子對接

在蛋白數(shù)據(jù)庫RCSB(https：//www.rcsb.org/)輸入“1.2”項得到的共同靶點，獲得各個靶點蛋白及原配體的分子結(jié)構(gòu)式，另存為*.pdb格式文件。用PyMol軟件剝離蛋白結(jié)構(gòu)的水分子和原配體，另存為r.pdb格式文件。分別將“1.1”項得到的阿魏酸結(jié)構(gòu)式原配體和靶點蛋白上傳到Swiss Dock平臺(http：//www.swissdock.ch/)進(jìn)行分子模擬對接。

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸的相關(guān)信息及靶點預(yù)測

檢索臺灣中醫(yī)藥資料庫，得到阿魏酸的分子結(jié)構(gòu)式(圖2)。在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中檢索阿魏酸得到 106個基因靶點，與Gene Card、Open Targets平臺搜索得到的靶點基因進(jìn)行比對，得到29個共同靶點基因，見圖3。

圖2 阿魏酸的分子結(jié)構(gòu)式

圖3 共同靶點的韋恩圖

2.2 核心基因Hub的篩選

將29個共同靶點上傳到STRING平臺，得到蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)。利用Cytoscape軟件中的插件“MCODE”對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，得到6個核心基因分別是STAT3、CASP3、MTOR、AR、MAPK1和ERBB2。見圖5。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 Hub基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 基因本體(GO)和京都基因百科全書KEGG信號通路富集

將共同靶點上傳到David數(shù)據(jù)平臺，進(jìn)行GO和KEGG富集分析。生物過程(BP)包括62個條目，涉及細(xì)胞增殖調(diào)控、信號傳導(dǎo)、調(diào)控RNA聚合酶III啟動子轉(zhuǎn)錄、調(diào)控Stat3蛋白酪氨酸磷酸化和磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)等；細(xì)胞組成(CC)包括17個條目，涉及質(zhì)膜、受體復(fù)合物、膜、鉀通道復(fù)合物和細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)等；分子功能(MF)包括24個條目，涉及酶結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合和G蛋白偶聯(lián)腺苷受體活性等。按P-Value值進(jìn)行排序，篩選排名前20列表(表1)、制圖(圖6)。

表1 基因本體GO數(shù)據(jù)(排名前20)

圖6 GO富集分析結(jié)果氣泡圖

KEGG富集分析包含33條信號通路(P<0.05)，涉及缺氧誘導(dǎo)因子-1信號通路、Rap1 信號通路、鞘脂信號通路和叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子信號通路等。按P-Value進(jìn)行排序，選取排名前20列表(表2)、制圖(圖7)。

表2 KEGG富集分析(排名前20)

圖7 KEGG通路基因富集結(jié)果氣泡圖

2.4 阿魏酸與心肌肥大主要靶點的分子對接

將6個Hub基因STAT3、CASP3、MTOR、AR、MAPK1和ERBB2分別上傳到蛋白數(shù)據(jù)庫RCSB，得到相對應(yīng)的PDB蛋白，分別是4ZIA、3DEH、3LMG、4DRJ、5IR3和4O6E。將阿魏酸、原配體、靶蛋白分別上傳到Siwss Dock平臺進(jìn)行分子模擬對接，結(jié)果用USCF Chimera軟件查看。見表3。

對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，阿魏酸與6個靶點的親和力均<-5 kcal/mol(查閱相關(guān)文獻(xiàn)報道分子結(jié)合的親和力<5 kcal/mol，表明結(jié)合較緊密[8-9])，其中MAPK1、ERBB2、CASP3的親和力最高，分別是-6.8、-6.4、-6.2 kcal/mol，它們分別與阿魏酸(紅色表示)、原配體(藍(lán)色表示)對接，見圖8、圖9和圖10。

圖8 阿魏酸與MAPK1

圖9 阿魏酸與ERBB2

表3 阿魏酸與6個主要靶點的分子對接

圖10 阿魏酸與CASP3

3 討論

心肌肥厚又稱心臟肥大，具有病理性特征，常見于高血壓、房顫、心衰及心臟瓣膜疾病患者。產(chǎn)生的機理與自身供氧不足或血壓過高有一定關(guān)聯(lián)，心臟為了對抗長期壓力負(fù)荷，或心肌力量不足，而產(chǎn)生一種代償反應(yīng)。心肌肥厚并不能增強原有心臟功能，相反易造成心臟彈性變差，舒張功能降低，心室腔減少，病情嚴(yán)重者甚至發(fā)生心衰和心律失常，威脅生命安全[10]。蔡珊珊等[11]將心衰阿魏酸組與心衰組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)心衰阿魏酸組左心室內(nèi)徑減小，室壁肥厚程度降低，射血分?jǐn)?shù)呈顯著升高(P<0.05)，推測阿魏酸可能通過抑制小鼠心肌MMP9的表達(dá)，在一定程度上改善心臟功能。王一春等[12]通過研究阿魏酸對2型糖尿病小鼠心肌損傷的影響，發(fā)現(xiàn)阿魏酸組的小鼠體重、心臟質(zhì)量和心肌質(zhì)量指數(shù)，與模型組相比明顯降低(均P<0.05)；模型組小鼠心肌細(xì)胞腫脹肥大，可見明顯纖維增生，阿魏酸干預(yù)后心肌腫脹情況和纖維增生情況明顯減輕，因此推斷阿魏酸具有減輕2型糖尿病小鼠心臟損傷、心肌纖維化的作用。上述研究表明阿魏酸有調(diào)控心肌細(xì)胞、改善心功能的作用，但相關(guān)作用機制尚不明確。

本研究通過檢索化合物、疾病靶點數(shù)據(jù)庫，挖掘出29個阿魏酸調(diào)控心肌肥厚靶點。通過對靶點的蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)分析，挖掘出6個核心靶點，分別是STAT3、CASP3、MTOR、AR、MAPK1和ERBB2。STAT3、MTOR和MAPK1具有調(diào)控細(xì)胞生長、增殖作用；CASP3可控制細(xì)胞凋亡；AR為雄性激素受體，與雄性激素結(jié)合刺激蛋白質(zhì)合成代謝，可促進(jìn)氮沉積和增加肌纖維的數(shù)量和厚度等；ERBB2為表皮生長因子EGFR家族成員之一。將阿魏酸與6個核心靶點進(jìn)行分子對接，結(jié)果親和力均<-5 kcal/mol，其中MAPK1、ERBB2和CASP3結(jié)合得更加緊密，可能是阿魏酸作用的關(guān)鍵靶點。MAPK1又稱絲裂原活化蛋白激酶-1，屬于MAPK(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族成員。MAPK家族主要分為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulatedd kinases，ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)和p38 MAPK三類[13]。MAPK家族能誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白磷酸化，產(chǎn)生生理效應(yīng)，參與調(diào)控各種細(xì)胞功能，如生長、分裂、繁殖、運動、應(yīng)激和凋亡[14-16]。CASP3又名半胱天冬蛋白酶3(Caspase-3)，參與機體內(nèi)的蛋白水解反應(yīng)、細(xì)胞凋亡，并引導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通常情況下，細(xì)胞凋亡是機體正常細(xì)胞在基因調(diào)控下的程序性死亡，然而當(dāng)T細(xì)胞受到外界干擾，被異常活化，加快清除機體內(nèi)衰老細(xì)胞，而Caspase-3在T細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用[17-18]。ERBB2屬于表皮生長因子受體家族ERBB，主要由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域胞質(zhì)酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域組成[19]，現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)有四種亞型：ERBB1、ERBB2、ERBB3和ERBB4。常曉等[20]研究黃芪多糖介導(dǎo)NRG-1/ErbB信號通路對糖尿病心肌細(xì)胞凋亡的作用時，發(fā)現(xiàn)黃芪高劑量組和二甲雙胍組的ERBB2表達(dá)較正常組顯著增加，因此提出ERBB2可能與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)的假設(shè)。此外，相關(guān)文獻(xiàn)報道NRG-1/ERBB信號通路在調(diào)控心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、生長、增殖、凋亡，以及維持其內(nèi)在性能完整性方面有不可替代的作用[21-23]。HEDHLI等[24]研究小鼠在超負(fù)荷壓力作用下心肌功能變化時，發(fā)現(xiàn)小鼠左心室ERBB2和ERBB4的mRNA水平升高，但當(dāng)心力衰竭時，ERBB2/ERBB4的mRNA和蛋白表達(dá)水平低于對照組，因此得出ERBB分子在心肌肥厚轉(zhuǎn)變成心衰過程中起著重要作用的結(jié)論。

對共同靶點進(jìn)行GO和KEGG富集分析，GO分析包含細(xì)胞增殖調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、蛋白磷酸酶結(jié)合及酶結(jié)合等。KEGG富集的主要信號通路是缺氧誘導(dǎo)因子-1信號通路(HIF-1 signaling pathway，P<0.05)。細(xì)胞是組成人體結(jié)構(gòu)的基本單位，細(xì)胞的生長、繁殖需要外界提供有氧環(huán)境，但當(dāng)環(huán)境的供氧不足或低下，會導(dǎo)致細(xì)胞新陳代謝發(fā)生紊亂，為了應(yīng)對缺氧環(huán)境，機體啟動復(fù)雜的反應(yīng)機制，缺氧誘導(dǎo)因子-1信號通路在其中發(fā)揮著重要作用。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是由120kD的HIF-1α亞單位和91～94kD的HIF-1β亞單位組成的異源二聚體[25]。相關(guān)報道顯示，缺氧誘導(dǎo)因子-1信號通路與磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3K)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子κB(NF-κB)及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)有著密切聯(lián)系[26]，而這些激酶參與了調(diào)控細(xì)胞增殖、生長和凋亡。

綜上所述，阿魏酸可作用于多個靶點、信號通路來調(diào)控心肌肥厚，但其作用效果仍需要進(jìn)一步深入研究。