不同生長階段白花蛇舌草高效液相色譜指紋圖譜及化學模式識別

黃家輝

（中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○○醫院藥劑科，福建 福州 350000）

白花蛇舌草屬茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa的干燥全草，為民間常用傳統中藥材，味苦、甘，性寒，其葉形如舌，花白色，又名蛇舌癀、羊須草，主要分布于我國廣西、湖南、云南等地［1-2］。現代藥理學研究表明，白花蛇舌草含環烯醚萜類（車葉草苷、去乙酰車葉草酸酐）、黃酮類（槲皮素、蘆丁和山柰酚）、三萜類、有機酸類（阿魏酸、4 - 香豆酸）等成分，具有抗氧化及增強非特異性免疫作用，對多種腫瘤細胞有抑制作用［3-4］。主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）法是化學模式識別常用的技術手段，具有直觀、可視化的分類效果和高精度的預測性，廣泛應用于中藥材的質量評價［5］。白花蛇舌草化學成分復雜，毒副作用小，臨床應用廣泛，但缺乏法定的質量控制方法，僅收載于各省的中藥材炮制規范。雖已有文獻報道運用高效液相色譜（HPLC）法測定該藥材中槲皮素、熊果酸、車葉草苷等多種成分的含量［6-8］，但未報道不同生長階段白花蛇舌草化學成分的變化。為全面、整體監控白花蛇舌草整個生長階段的質量，本研究中采用HPLC 法分析白花蛇舌草的生長期、開花期、結果期3 個生長階段指紋圖譜的差異，篩選差異標志物，并通過PCA 及OPLS-DA法分析白花蛇舌草的最佳采收期，為其質量控制提供理論支持。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695 - 2998 型高效液相色譜儀（美國沃特世公司），配有2998型二極管陣列檢測器（DAD）；AL105A 型電子天平（梅特勒-托利多儀器<上海>有限公司，精度為0.01 mg）；Elmasonic P 型超聲波清洗器（德國Elma公司，功率為350 W，頻率為40 kHz）；QYSW-20A型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

對照品車葉草苷（批號為181117，含量≥98.0%），去乙酰車葉草酸酐（批號為190121，含量≥96.0%），山柰酚（批號為180928，含量≥98.0%），均購于成都瑞芬思科技有限公司；對照品4 - 香豆酸（批號為112037 -201801，含量以99.3%計），阿魏酸（批號為110773 -202015，含量以99.2%計），槲皮素（批號為100081 -202010，含量以 98.3% 計），蘆丁（批號為 100080 -202012，含量以92.5%計），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，其他試劑均為分析純；12 批白花蛇舌草（編號為S1-S12）來源于安徽亳州皖北中藥材種植基地，陰干，經福建中醫藥大學黃葉方教授鑒定均為正品。采收時間與生長階段見表1。

表1 12批白花蛇舌草采收時間與生長階段Tab.1 Harvest time and growth stages of 12 batches of Hedyotis diffusa

2 方法與結果

2.1 色譜條件［9-11］

色譜柱：ShiseidoCapcellPakMGC Ⅱ-C18柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）- 0.15%醋酸溶液（B），梯度洗脫（0～19 min時6%A，19～35 min時6%A →10%A，35～42 min 時 10%A → 35%A，42～62 min 時35%A → 65%A）；流速：0.9 mL/min；檢測波長：238 nm（0～10 min 時去乙酰車葉草酸酐，19～35 min 時車葉草苷），306 nm（10～19 min 時 4 - 香豆酸），323 nm（35～42 min 時阿魏酸），369 nm（42～62 min 時槲皮素、蘆丁及山柰酚）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

分別取車葉草苷、去乙酰車葉草酸酐、4-香豆酸、阿魏酸、槲皮素、蘆丁、山柰酚對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解并定容，制成質量濃度分別為225.4，196.8，162.7，200.1，207.9，151.5，181.5 μg/ mL 的混合對照品溶液。取粉碎過2 號篩的白花蛇舌草1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲提取（功率為350 W，頻率為40 kHz，溫度為30 ℃）40 min，放冷至室溫，再次稱定質量，并用甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

精密度試驗：取白花蛇舌草（編號為S11）適量，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次。結果以11號峰車葉草苷為參照峰，17個共有峰相對保留時間的RSD為0.17%～0.65%（n=6），相對峰面積的RSD為0.29%～1.02%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取白花蛇舌草（編號為S11）適量，依法制備供試品溶液，于室溫下放置0，5，10，15，20，24，36 h時按2.1項下色譜條件進樣測定。結果以11號峰車葉草苷為參照峰，17 個共有峰相對保留時間的RSD為0.28%～0.77%（n=7），相對峰面積的RSD為0.46%～1.83%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置36 h內穩定性良好。

重復性試驗：取白花蛇舌草（編號為S11）適量，依法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果以11號峰車葉草苷為參照峰，17個共有峰相對保留時間的RSD為0.67%～1.23%（n=6），相對峰面積的RSD為0.89%～2.44%（n=6），表明方法重復性良好。

2.4 HPLC 指紋圖譜研究

參照峰選定：取12批（編號為S1-S12）白花蛇舌草各適量，依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果色譜圖中11 號峰車葉草苷的保留時間適中，峰面積最大且分離度好，故以車葉草苷為參照峰。

相似度評價：采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012 版分析12 批（編號為S1-S12）白花蛇舌草的色譜圖。以S11為參照圖譜，多點校正全峰匹配，12批白花蛇舌草HPLC 疊加指紋圖譜見圖1。標定了17個共有峰，以對照圖譜為參照進行相似度計算，12批白花蛇舌草的相似度分別為 0.735，0.717，0.755，0.763，0.862，0.818，0.835，0.849，0.942，0.936，0.953，0.937，表明12 批白花蛇舌草在生長期、開花期、結果期3 個不同生長階段間存在一定差異。

圖1 12批白花蛇舌草高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 12 batches of Hedyotis diffusa

相對保留時間和相對峰面積：12批（編號為S1-S12）白花蛇舌草指紋圖譜中，各共有峰相對保留時間的RSD為0.21%～1.83%，共有峰相對峰面積的RSD為3.73%～39.18%，表明12 批白花蛇舌草共有峰的出峰時間相對穩定，峰面積相差較大，白花蛇舌草不同生長階段間存在差異。

共有峰指認及相關分析：通過保留時間指認出7個色譜峰，分別為3 號峰去乙酰車葉草酸酐（保留時間7.896 min）、5 號峰4- 香豆酸（保留時間17.058 min）、11 號峰車葉草苷（保留時間32.288 min）、12 號峰阿魏酸（保留時間37.045 min）、15 號峰蘆丁（保留時間45.187min）、16 號峰槲皮素（保留時間48.966 min）、17 號峰山柰酚（保留時間53.884 min）。詳見圖2。

圖2 混合對照品溶液高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference solution

2.5 PCA

采用SPSS 24.0統計學軟件分析，導入17個共有指紋峰數據，采用因子分析項下PCA 分析12 批不同生長階段白花蛇舌草的主成分，并生成因子得分系數（FACn）。將提取的3 個主成分（特征值 >1.0）通過權重系統組合，可得綜合得分公式F=0.513f1+0.196f2+0.102f（3f代表3個主成分得分）。F值越高，白花蛇舌草指紋圖譜綜合得分越高。由表2可知，白花蛇舌草3個生長階段的綜合質量排序為結果期>開花期>生長期。

表2 主成分因子得分系數及綜合得分Tab.2 Factor score coefficients and comprehensive scores of PCA

2.6 OPLS-DA

為快速識別出3 個不同生長階段白花蛇舌草指紋圖譜的相似性和差異性，篩選出差異性成分，將17個共有指紋峰面積導入SIMCA 16.0 軟件，對12 批白花蛇舌草進行OPLS-DA。結果見圖3 和圖4。為綜合分析白花蛇舌草不同生長階段的差異性，提取3 個主成分，設置分類Y矩陣變量隨機排列進行置換檢驗，結果見圖5。模型解釋率參數（R2）= 0.984 > 0.5，預測能力參數（Q2）=0.968 > 0.5，表明所建模型預測能力較強；R2擬合直線和Q2擬合直線在Y坐標軸的截距分別為0.041 1 和-0.349 0，表明所建模型不存在過擬合現象。

圖3 OPLS-DA荷載散點圖Fig.3 Loading plot of OPLS - DA

圖4 OPLS-DA VIP圖Fig.4 VIP plot of OPLS - DA

圖5 OPLS-DA模型置換檢驗圖Fig.5 Permutation test of OPLS - DA

由圖3 可知，OPLS - DA 模型中所有數據點均在95%置信區間內，表明生長期、開花期、結果期3個生長階段白花蛇舌草的化學成分及含量存在一定差異，但同一生長階段樣品的相似度高。由圖4可知，峰13、峰12、峰4、峰16、峰3、峰17 的變量重要性投影值（VIP）均大于1，分別為2.02，1.64，1.23，1.19，1.08，1.01，即為差異標志物，這6 個化合物對結果權重的影響率大于50%。因此，引起不同生長階段白花蛇舌草含量差異的主要標志性成分分別為峰13、峰12（阿魏酸）、峰4、峰16（槲皮素）、峰3（去乙酰車葉草酸酐）、峰17（山柰酚）。

3 討論

3.1 色譜條件優化

最佳檢測波長選擇：用DAD 對車葉草苷、去乙酰車葉草酸酐、4 - 香豆酸、阿魏酸、槲皮素、山柰酚對照品甲醇溶液的紫外- 可見光（200～400 nm 波長范圍內）進行全波長掃描，得到最大波長分別為車葉草苷及去乙酰車葉草酸酐（λmax= 238 nm），4 - 香豆酸（λmax=306 nm），阿魏酸（λmax=323 nm），槲皮素、蘆丁及山柰酚（λmax=369 nm），故選擇分段變換波長檢測法檢測上述7種成分。

流動相選擇：由于白花蛇舌草中7種化學成分的極性相差較大，本研究中選用不同流動相體系［乙腈-水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-醋酸溶液（0.10%，0.15%，0.20%）］進行梯度洗脫，以優化色譜條件。結果表明，流動相體系為乙腈-醋酸溶液時對色譜峰峰形和保留時間均有明顯影響。不加醋酸時，色譜峰出現不同程度拖尾；加入醋酸后，隨著濃度的增加，色譜峰的對稱性增加。考慮到色譜柱的耐酸范圍，最終選擇乙腈-0.15%醋酸溶液為流動相。

3.2 化學模式識別分析

指紋圖譜作為一種綜合的可量化技術手段，能反映中藥內在化學成分的多變量信息和數據，但目前所采用的指紋圖譜相似度評價系統缺乏多維立體性［12-13］。化學模式識別技術可迎合指紋圖譜的整體性和模糊性要求，利用統計學軟件對所含成分進行分類，可對指紋圖譜進行多維綜合分析，實現數據的識別功能［14-15］。本研究中通過PCA 模型間接反映了不同生長階段白花蛇舌草的綜合質量；OPLS-DA 模型判別出白花蛇舌草生長期、開花期、結果期3 個生長階段的指紋圖譜，篩選出6 個差異標志物，并通過對照品比對確認出4 種成分，分別為3 號峰去乙酰車葉草酸酐、12 號峰阿魏酸、16號峰槲皮素、17號峰山柰酚。

3.3 方法評價

本研究中建立了3個生長階段白花蛇舌草的HPLC指紋圖譜分析方法，確定出了17個共有指紋峰，經化學模式識別技術確定最佳采收期為結果期，并篩選出6個差異標志物，可為完善白花蛇舌草的質量標準提供參考。