地塞米松磷酸鈉注射液仿制制劑與原研制劑有關物質比較*

路愜楠，王 柳，孫 婷，張軼華

（河北省藥品醫療器械檢驗研究院·國家藥品監督管理局仿制藥質量控制與評價重點實驗室，河北 石家莊 050200）

地塞米松磷酸鈉注射液為人工合成的長效糖皮質激素，是潑尼松龍的氟化衍生物，具有抗炎、抗病毒、抗休克、免疫抑制作用，是搶救危重癥患者不可缺少的急救藥品。由主藥地塞米松磷酸鈉與輔料煙酰胺、無水亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、依地酸二鈉制成，其中無水亞硫酸鈉為抗氧劑。目前，已有對醋酸地塞米松原料藥［1-2］和地塞米松磷酸鈉注射液［3-7］中雜質Ⅰ開展的研究。為此，本研究中以原研Aspen公司在英國上市的地塞米松磷酸鈉注射液為參比制劑，根據仿制藥一致性評價的相關規定，采用反向分析技術，對標原研制劑質量。本品變更處方，不再添加抗氧劑亞硫酸鈉，故不存在雜質Ⅰ。采用反相高效液相色譜法有效分離主成分與7 個已知雜質A-G，對仿制制劑和原研制劑的有關物質進行了研究?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司），配有Waters e2695泵、2489型紫外可見光檢測器、Empower色譜工作站；XPR26/A型電子天平（瑞士梅特勒公司，精度為0.01 g）；KS-7200XDS型超聲儀（昆山潔力美超聲儀器有限公司，功率為400 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

乙酸銨和乙酸均為分析純，購自天津科密歐化學試劑有限公司；甲醇（色譜純，Merck 公司）；試驗用水為超純水；地塞米松磷酸酯對照品（批號為101116 -201803，含量為99.1%），倍他米松磷酸鈉（雜質B）對照品（批號為100180-201804，含量為92.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；地塞米松磷酸鈉《歐洲藥典》（EP）系統適用性對照品［批號為Y000147（2.0）］，包含地塞米松（雜質A）及雜質C，D，E，F，G；原研制劑（AspenPharma?TradingLimted，批號為16083TB23，規格為3.8 mg∶1 mL）；仿制制劑（批號分別為2102203，2102204，2102205，規格為1 mL∶5 mg）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Kromasil C8柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：以0.1 mol/L 乙酸銨溶液（用乙酸調pH 至3.8）-甲醇（65∶35，V/V）為流動相A，以0.1 mol/L 乙酸銨溶液（用乙酸調pH至4.0）-甲醇（30∶70，V/V）為流動相B，梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL。系統適用性試驗溶液在此色譜條件下的色譜圖見圖1，地塞米松磷酸鈉與各雜質分離度良好。理論板數按地塞米松磷酸鈉峰計應不低于3 000，雜質B 與地塞米松磷酸鈉的分離度應不低于1.5。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Program of gradient elution of mobile phase（%）

圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the system suitability test

2.2 溶液制備

取雜質B 對照品2 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用流動相A 定容，搖勻，即得雜質B 對照品溶液。取地塞米松磷酸鈉EP系統適用性對照品（包含雜質A，C，D，E，F，G）2 mg，精密稱定，置2 mL 容量瓶中，加上述溶液1 mL，再用流動相A 定容，搖勻，即得系統適用性試驗溶液。取樣品適量，加流動相A 制成每1 mL 含地塞米松磷酸鈉1 mg 的供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL，置200 mL容量瓶中，用流動相A定容，搖勻，即得對照品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察：取雜質B 對照品2.50 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加流動相A 超聲2 min 使溶解并定容，搖勻，作為雜質B對照品貯備液；取地塞米松磷酸酯對照品2.75 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加流動相A超聲2 min使溶解并定容，搖勻，作為地塞米松磷酸酯對照品貯備液。分別精密量取上述對照品貯備液，用流動相分別稀釋制成線性關系考察溶液。分別精密量取20 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。結果見表2。

表2 線性關系考察結果、相對保留時間和相對校正因子Tab.2 Results of the linear relation test，relative retention time and relative correction factors

檢測限和定量限確定：取對照品貯備液適量，用流動相A逐步稀釋成不同的質量濃度，按2.1 項下色譜條件分別進樣20 μL。以信噪比（S/N）為3 和10 時的含量為檢測限和定量限。結果主成分地塞米松磷酸鈉、雜質B的檢測限分別為4 ng和10 ng，定量限分別為12 ng和30 ng。

精密度試驗：取2.2 項下供試品溶液，按擬訂色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖。結果地塞米松磷酸鈉、雜質B峰面積的RSD分別為0.21%和0.48%（n=6）。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液，分別于室溫下放置2，4，8，12 h時按2.1項下色譜條件重復進樣2次，記錄色譜圖。結果地塞米松磷酸鈉含量的RSD分別為0.33%，0.78%，1.02%，1.13%（n= 2）；雜質B 含量的RSD分別為0.53%，0.92%，1.51%，1.63%（n=2），表明供試品溶液室溫下放置12 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取地塞米松磷酸酯對照品及片劑空白輔料，按處方比例制備空白溶液，分別加入高、中、低濃度地塞米松磷酸酯、雜質B 對照品，按擬訂色譜條件進樣測定，以外標法分別計算回收率，結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n=3）Tab.3 Results of the recovery test（n=3）

2.4 仿制制劑和原研制劑有關物質測定

按2.1項下色譜條件進樣測定，以加校正因子的自身對照法計算雜質A和B的含量，以自身對照法計算雜質C，D，E，F，G 和其他單個雜質。供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，以對照溶液中地塞米松磷酸酯峰面積計，雜質A，B（相對校正因子1.14），C，D，E，F，G 的含量均不得大于0.5%，其他單個雜質的含量不得過0.2%，各雜質總和不得過2.0%。仿制制劑和參比制劑高效液相色譜圖見圖2，含量測定結果見表4。

表4 有關物質含量測定結果（%）Tab.4 Results of content determination of related substances（%）

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

3 討論

本品主成分為地塞米松磷酸鈉，以地塞米松磷酸酯對照品進行方法學考察，包括線性關系考察、檢出限、定量限等，故均以地塞米松酸酯折算為地塞米松磷酸鈉。2020 年版《中國藥典（二部）》收載的地塞米松磷酸鈉注射液標準中，將雜質Ⅰ作為已知雜質控制其含量。也有多篇文獻對雜質Ⅰ的控制方法進行研究，且有文獻指出，雜質Ⅰ是抗氧劑亞硫酸氫鈉與主成分在高溫下的加成產物［8-9］。經與原研制劑比較分析，變更仿制制劑的處方組成后不再添加抗氧劑（亞硫酸鈉），經試驗分析，未檢出雜質Ⅰ，仿制制劑中雜質的種類和含量均與原研制劑一致。所建立方法可有效控制仿制制劑中的已知雜質和未知雜質。

注射劑中除溶劑外，可根據藥物的理化性質加入適宜輔料，如pH 調節劑、助溶劑、抗氧劑、抑菌劑等。但地塞米松磷酸鈉注射液中加入抗氧劑后，導致雜質Ⅰ的生成，致使主藥藥量減少，嚴重影響藥物的有效性，且新增雜質毒性未知。為保證仿制制劑與原研制劑同等的療效，有必要優化處方工藝，并重視藥物與輔料的相容性考察，避免因處方中輔料與主藥配伍不當而對產品質量產生不良影響，甚至對身體健康造成危害。