高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中殘留的8 種磺胺類藥物

楊開智 梁 丹 黃生林

（常德市畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心，湖南 常德 415000）

磺胺類（Sulfonamides,SAs）藥物為常見的合成抗菌劑，主要用于預(yù)防和治療細菌性感染疾病，具有抗菌譜廣、低毒高效、組織穿透力強，并且價格低廉等特點，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到普遍的使用。但這類藥物的大量使用會導致在水產(chǎn)品中的殘留，進而通過食物鏈危害人類的健康。SAs藥物對人體腎臟和肝臟有損害的毒副作用，破壞人的造血系統(tǒng)，引起溶血性貧血癥，而磺胺二甲基嘧啶甚至有潛在的致癌可能。同時這兩類藥物在養(yǎng)殖中大量的使用，均容易使病原體產(chǎn)生耐藥性[1]。

目前測定動物源性食品中磺胺類藥物殘留的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[2-3]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[4-5]。液相色譜法一般使用紫外和熒光檢測器，由于動物源性食品中蛋白質(zhì)和脂肪含量較高、基質(zhì)復(fù)雜等原因，采用該方法容易受雜質(zhì)影響，并且分析時間較長，較費時費力。近年來，對這兩類藥物殘留同時檢測的報道也越來越多，但是大部分集中在畜禽組織和牛奶中。

本文針對農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品檢測中心在水產(chǎn)品例行監(jiān)測中經(jīng)常檢測的8 種磺胺類藥物建立了同時測定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法提高了色譜分析的功效，簡單快速，靈敏度高，而且節(jié)約成本，能實現(xiàn)藥物殘留的快速檢測，適合水產(chǎn)品當中磺胺類藥物的殘留檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo TSQ Quantum 液相色譜- 高分辨串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配用電噴霧離子（ESI）源（Thermo 公司）。超聲波清洗器（昆山超聲波儀器廠），平行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi(布奇)公司），高速冷凍離心機（日本日立公司），微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠），精密電子天平（梅特勒—托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司）。

磺胺類藥物標準品（磺胺噻唑、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺多辛、磺胺嘧啶、磺胺二甲異惡唑、磺胺喹惡啉）以及內(nèi)標物（氘代磺胺間二甲氧嘧啶、氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶） 的純度不低于99.8%；甲醇、甲酸、醋酸銨均為色譜純（美國Tedia 公司）；無水硫酸鈉：分析純，于650 ℃下灼燒4 h 后儲存于干燥器中備用。

標準儲備液的配置：分別稱取磺胺類藥物標準品各10.0 mg，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配置成100 mg/L 的標準儲備液，在-18 ℃下避光保存。使用時將上述標準儲備液混合，用甲醇稀釋成不同濃度的標準工作液。

內(nèi)標儲備液及使用液的配置：分別稱取10.0 mg 各內(nèi)標標準品，用甲醇溶解并定容，配成100 mg/L 的標準儲備液，在-18 ℃下避光保存。準確吸取各內(nèi)標儲備液，用甲醇逐級稀釋配成1.0mg/L 的混合內(nèi)標使用液，在-18 ℃下避光保存。

1.2 儀器分析

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Capcell Pak C18(MGⅡ，150 mm×2.1 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃，進樣量為10μL，流動相A 為甲醇；B 為2 mmoL/L 的乙酸銨溶液（含0.1%的甲酸）；梯度洗脫程序為：0-6 min，10%A-60%A；6-8 min，60%A-80%A；8-13 min，80%A-90%A；13-14 min，90%A-10%A，并保持2 min；流速為250 μL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

采用大氣壓電噴霧離子源（ESI），正離子模式；噴霧電壓為4 000 V；離子傳輸毛細管溫度為350 ℃，Q1 半峰寬為0.7Da；Q3 半峰寬為0.7Da；碰撞氣氬氣壓力為1.5 mTorr；鞘氣流量為10 L/min；輔助氣流量為2 L/min；采用選擇反應(yīng)監(jiān)測模式（SRM），各種磺胺類藥物的母離子、子離子和碰撞能量見表1。

表1 10 種藥物的SRM 采集參數(shù)和標準曲線

1.3 樣品前處理

稱取5 g 樣品（精確至0.01 g）至于離心管中，加入10 g 烘干備用的無水硫酸鈉后，立刻用玻璃棒攪勻，然后加入20 mL 乙腈提取液，在漩渦混合儀上充分混合1 min，然后再超聲振蕩20 min，平衡后放入離心機5 000 r/min 離心10 min 待分層，吸取上層清液至100 mL 雞心瓶中，重復(fù)加20 mL 乙腈提取液提取一次，合并乙腈提取液，于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。準確加入1.0 mL 甲醇-2 mmol/L 乙酸銨溶液（2∶8，V：V，含0.1%甲酸）溶解殘渣，為了防止脂肪和雜質(zhì)的影響，加入2.0 mL 正己烷去脂，漩渦混勻1 min，取下層液體過0.22 μm 濾膜，供液質(zhì)聯(lián)用儀分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的選擇及優(yōu)化

由于水產(chǎn)品成分比較復(fù)雜，基質(zhì)中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及色素等雜質(zhì)。本文比較了乙腈和正己烷兩種提取液，兩種提取液回收率均滿足要求，但是由于正己烷對脂肪溶解度大，容易造成對質(zhì)譜的污染。而乙腈能提取大多數(shù)目標物，并且提取效果好，乙腈使蛋白質(zhì)變性凝結(jié)沉淀下來后通過離心除去；前處理中加入無水硫酸鈉是為了有效除去水產(chǎn)品基質(zhì)當中含有的水分，同時無水硫酸鈉還可以促使使蛋白質(zhì)變性分散，防止樣品結(jié)成塊狀影響提取效果；最后加入正己烷可溶解一些脂肪、蛋白質(zhì)和色素，經(jīng)離心后除去，過0.22 μm 濾膜后溶液清亮，回收率實驗滿足要求。

本文對定容溶液進行了選擇，有研究采用甲醇-水（2∶8，V：V）進行定容[6]，本實驗發(fā)現(xiàn)當使用甲醇- 水（2∶8，V：V） 定容時，溶液渾濁，但進樣后峰形不尖銳，有加合峰，分叉峰出現(xiàn)，信號靈敏度下降，保留時間不穩(wěn)定；經(jīng)多次試驗，發(fā)現(xiàn)采用甲醇-2 mmol/L 乙酸銨溶液（2∶8，V：V，含0.1%甲酸）定容，溶液澄清，進樣后色譜峰峰形尖銳，對稱性好，保留時間穩(wěn)定，回收率也滿足分析要求。因此本文采用甲醇-2 mmol/L 乙酸銨溶液（2∶8，V：V，含0.1%甲酸）作為定容溶液。

2.2 色譜條件的選擇及優(yōu)化

流動相的PH 值會影響磺胺類藥物在色譜柱中的分離。本實驗比對了甲醇-水，甲醇-甲酸水溶液（0.1%），甲醇-乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）三種不同的流動相。當采用甲醇-水為流動相時，各種磺胺類藥物幾乎在同一時間被洗脫，而且出峰時間極短，大概在1min 之內(nèi)出峰，這可能是由于磺胺類藥物在中性流動相中具有相同的保留因子，而出峰時間太快對質(zhì)譜會造成污染；當采用甲醇-甲酸水溶液（0.1%）作為流動相時，各種目標物峰形得到了較大的改善，保留時間也較穩(wěn)定，但SAs 中幾種目標物出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，峰形不夠尖銳；本實驗考慮采用揮發(fā)性電解質(zhì)乙酸銨來做為流動相，同時加入0.1%甲酸控制流動相PH 值，采用合適的梯度洗脫程序，不但很好的實現(xiàn)了各種目標物的分離，并且得到了比較理想的色譜峰，峰形尖銳且對稱性好，增大了分子離子峰的峰強度。見下圖1。

圖1 空白基質(zhì)中10.0μg/kg 磺胺類藥物加標樣品離子色譜圖

2.3 質(zhì)譜條件的選擇及優(yōu)化

根據(jù)目標物的結(jié)構(gòu)特征，選擇ESI 正離子電離模式對1.0 mg/L 的8 種磺胺類混合標液進行一級質(zhì)譜全掃描分析，m/z 掃描范圍為200-400 之間，得到每種藥物的分子離子，然后以該分子離子為母離子，進行子離子掃描，選取豐度最強的碎片離子為定量離子，豐度次強的碎片離子為定性離子。在此基礎(chǔ)上對錐孔電壓和碰撞能量進行優(yōu)化，使選定的母離子和子離子組成的特征離子的豐度和比例達到最佳。得到1.2.2 中最佳質(zhì)譜條件。

2.4 線性范圍和靈敏度

磺胺二甲異惡唑、磺胺喹惡啉以氘代磺胺間二甲氧嘧啶為內(nèi)標；磺胺噻唑、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺多辛、磺胺嘧啶以氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶為內(nèi)標。配置10.0-500.0 μg/L 的混合標準溶液，以標準品與內(nèi)標物峰面積比值Y 為縱坐標，工作溶液的質(zhì)量濃度X(μg/L)為橫坐標制作標準曲線，結(jié)果表明，各種SAs 的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)符合要求，見表1。

在空白樣品基質(zhì)中添加8 種磺胺類藥物的混合標準溶液，以每種目標峰高的信噪比（S/N）大于5 確定為方法的檢出限，信噪比（S/N） 大于10 確定為方法的定量限，9 種SAs 的檢出限(LOD) 為1.0 μg/kg，定量限(LOQ)為2.0 μg/kg，表明該方法滿足國家對水產(chǎn)品檢測的要求。

2.5 回收率與精密度

在空白樣品中添加5、10、50μg/kg 三個水平的添加實驗，每個添加水平進行3 次實驗，每次平行測定6 次，按1.2 節(jié)所述條件進行加標回收率實驗，所得回收率結(jié)果為69.5%-121.9%，相對標準偏差為3.5%-14.6%，符合國內(nèi)外有關(guān)標準和法規(guī)的要求[7]，結(jié)果見表2。

表2 8 種藥物在空白樣品中的添加回收率和相對標準偏差（RSDs，n=6）

2.6 實際樣品測定

運用本文建立的方法對市場中的20 個水產(chǎn)品樣品進行了分析檢測。結(jié)果表明：該方法簡單、快速，具有很好的適用性和可操作性，譜圖無干擾，樣品中未檢出9 種SAs 藥物。

3 小結(jié)

本方法適用于各種不同基質(zhì)的水產(chǎn)品及其制品中磺胺類藥物的測定，前處理方法步驟簡單、試劑用量少、回收率穩(wěn)定、精密度好，方法的定量限為2.0μg/kg，滿足我國以及歐盟等國家的限量要求，可以作為水產(chǎn)品及制品中磺胺類藥物的檢測方法，并可為該類藥物在水產(chǎn)品中的消除規(guī)律及毒理評價提供靈敏、準確的分析手段，為水產(chǎn)品的安全工作提供了有力的保障。