QuEChERS-液相色譜-串聯質譜法測定豬肝中玉米赤霉醇含量的不確定度評估

劉曙光 周 燦 隆雪明 楊彥寧 歐海軍 張 港 陳福華 賀宇文

（湖南省獸藥飼料監察所，湖南 長沙 410006）

玉米赤霉醇，又名“右環十四酮酚”，是玉米赤霉菌正常新陳代謝過程中所產生的次級代謝產物—玉米赤霉烯酮的還原產物，是雷索酸內酯類非甾體類的同化激素。此外，ZAL 還是一種效果良好的皮埋增重劑，具有促進機體蛋白質的合成，提高飼料的轉化率和酮體瘦肉率的作用[1-3]，被冠以“畜大壯”之稱。實驗研究表明ZAL在哺乳動物中應用具有一定的危害性[4]。1998 年歐盟就禁止了以ZAL 為代表的激素類藥物在畜禽生產養殖上的應用。中國于2002 年發布農業部第193 號公告明確規定禁止ZAL 用于所有食品動物，且所有可食動物源性食品產品中不得檢出。2010 年衛生部明確將ZAL 列入動物源性食品中禁止添加使用的藥品及其他化合物名單。ZAL 是主要的玉米赤霉烯酮的代謝產物，分別為α-ZAL、β-ZAL，且兩者之間可以相互進行轉化[5]。李熠等[6]對ZAL 在體內的代謝和毒代動力學進行了較為詳細的研究，多達41 種α-ZAL的代謝產物及14 種隱蔽性α-ZAL 的代謝產物首次見諸報道，同時研究指出，α-ZAL 在體內代謝中有效釋放出其毒性原型，增加機體暴露的總量且具有顯著的種屬代謝差異性。此外，該項研究揭示了α-ZAL 致癌性。因此，基于α-ZAL在體內的快速代謝特性和其多種代謝產物總體展現出對動物和人的毒性，及現行檢測方法對α-ZAL 不得檢出的硬性要求，對《QuEChERS-液相色譜-串聯質譜法測定豬肝中玉米赤霉醇》方法進行不確定度評估是十分緊要的。

不確定度，作為一個新穎的質量評價體系術語，它的引入是為了從根本上改變隨機誤差或系統誤差的傳統分類，從大數據數理統計角度去測量結果的質量，相比于測量誤差等歷史統計值來修正測量結果[7-8]，主要用于表征合理賦予被測量的值的分散性。測量不確定度被認為是闡明檢測結果是否優良的關鍵性指標[9-11]，也是國際上推薦的用于定量評估測量結果的有效手段[12]，可分析和評定影響測量結果準確性的各個分量，充分掌握關鍵因素，提高結果的準確性和可靠性。本文根據JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》 和CNAS-GL006-2019《化學分析中不確定度的評估指南》的要求，參照相關文獻[13-16]，采用QuEChERS- 液相串聯質譜法對豬肝中α-ZAL、β-ZAL 的殘留進行風險監測，并對得到的不確定度結果進行綜合分析和評估，以此來探究影響不確定度的主要因素，為該方法后續在實際檢測工作中的應用提供一定的科學依據和理論基礎，此外，還可為其它的類固醇類激素藥物的殘留檢測方法的不確定度測量提供一個理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

三重四級桿質譜聯用儀：QTRAP 4500，美國SCIEX 公司；

超高效液相色譜儀：LC-30A，日本島津公司；

臺式高效冷凍離心機：X1R，德國Thermo公司；

電子天平：PL203，梅特勒- 托利多儀器（上海）有限公司；

固相萃取裝置：24TMDL，美國SUPELCO公司；

α- 玉米赤霉醇：100.4 μg/mL，天津阿爾塔β-玉米赤霉醇：100.4 μg/mL，天津阿爾塔乙腈：色譜純，美國默克；

QuEChERS 萃取鹽包：美國Agilent 公司；

Captiva EMR-Lipid：300 mg,3 mL，美 國Agilent 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制

分別用吸量管吸取質量濃度為100 μg/mL的2 種標準儲備液0.1 mL 至100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勻，即得100 ng/mL 的混合標準中間液。

分別吸取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL 混合標準中間液（100 ng/mL） 于空白試樣中，余下操作同2.3.2 處理。即得濃度為1、2、5、10、20 ng/mL 混合標準曲線工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

稱取5.00 g 豬肝試樣置于50 mL 離心管中，加入3 mL 水和陶瓷均質子，渦旋混勻1 min，加入10 mL 乙腈渦旋提取10 min，加入QuECh-ERS 萃取鹽包，混勻，低溫離心10 min，取上清液2.4 mL 至10 mL 離心管中，加入0.6 mL水混勻，過Captiva EMR-Lipid(300 mg, 3 mL)脂肪去除柱，擠干小柱，接收全部洗脫液，渦旋混勻，過0.2 μm Nylon 濾膜，濾液供高效液相-串聯質譜儀測定。

1.2.3 儀器條件

(1) 色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C8（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；流動相A 為2 mmol/L 乙酸銨0.05%乙酸水溶液，流動相B 為甲醇，（梯度洗脫程序見表1）。流速為0.3 mL/min，柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL。

表1 梯度洗脫程序

(2) 質譜條件

離子源：電子噴霧離子源（ESI），掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應監測（MRM）；電噴霧電壓（IS）：-4500 V；離子源溫度(TEM)：550 ℃；氣簾氣(CUR)∶10 psi；霧化氣（GS1）：50 psi；輔助加熱氣(GS2)：50 psi；碰撞氣(CAD)：Medium；質譜掃描參數見表2。

表2 質譜參數

1.2.4 殘留量計算公式

被測組分殘留量按以下公式計算：

式中：X—試樣中被測組分的含量，μg/kg；

C—試液中被測組分的濃度，μg/L；

V—萃取溶劑乙腈體積，mL；

f—試樣處理過程中的稀釋倍數（本方法為1.25）；

m—試樣的稱樣質量，g。

2 不確定度分析與評定

2.1 不確定度來源分析

根據檢測流程和殘留量計算模型分析，影響試樣中α-ZAL，β-ZAL 測定結果不確定度μrel(X)的主要因素有：

（1）待測液的濃度C 引入的相對標準不確定度μrel(C)；

（2） 試樣稱量m 引入的相對標準不確定度μrel(m)；

（3）試樣前處理V 引入的相對標準不確定度μrel(V)；

（4）測量回收率引入的不確定度μrel(R)；

（5） 測量重復性引入的相對標準不確定度μrel(χ)。

2.2 不確定度的評定

2.2.1 待測液的濃度C 引入的相對標準不確定度μrel(C)

分析整個實驗過程可知不確定度主要來源為標準溶液的配制和標準工作液曲線的擬合等過程。而標準溶液的配制主要包括標準儲備液的配制、稀釋和標準工作曲線制備等過程。

（1）儲備液引入的相對標準不確定度μrel(C1)

由標準物質證書可知，α-ZAL 標準溶液純度為99.9%，不確定度為±5%，采用均勻分布處理，則因純度引入的不確定度為

由標準物質證書可知，β-ZAL 標準溶液純度為99.9%，不確定度為±5%，采用均勻分布處理，則因純度引入的不確定度為

（2）混合標準中間液的配制引入的相對標準不確定度μrel(C2)

用分度吸量管吸取0.1 mL 標準混合儲備液至100 mL 容量瓶中，乙腈定容至刻度，混勻，即100 ng/mL 的混合標準中間液。根據常用玻璃量器規定，0.1 mL A 級分度吸量管、100 mL A級單標容量瓶及溫度波動引入的不確定度見表3。采用均勻分布，量具及溫度波動引入的不確定度見表3。

如表3，標準中間液引入的不確定

表3 標準中間液配制引入的不確定度

（3）標準曲線配制過程引入的相對標準不確定度μrel(C3)

標準曲線配制：分別用0.5 mL、1.00 mL、2.00 mL 吸量管（A 級）分別吸取混合標準中間液（100 ng/mL） 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL 于5 個空白試樣中，其余操作2.3.2 處理，即得1、2、5、10、20 ng/mL 的標準工作溶液。

表4 標準曲線配制過程引入的不確定度

如上所示，ZAL 標準曲線配制過程引入的不確定度：

（4）標準曲線擬合引入的相對標準不確定度μrel(C4)

本實驗采用外標法定量，標準系列為5 個點，每個濃度點測定2 次后以標準工作液濃度為橫坐標，相應濃度的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，結果見表5。

表5 標準曲線

標準溶液峰面積比值殘差的標準差，由公式

式中p 為對C0測定次數，p=5；n 為標準溶液測定次數n=10；為5 個標準溶液的平均濃度，樣品測定5 次后得到的平均濃度結果為C0（見表8），各相應的數值及計算結果見表6。

表6 線性回歸方程擬合引入的不確定度

綜上所述，α-ZAL 待測液的濃度C 引入的相對標準不確定度μrel(C)

同理可得，β-ZAL 待測液的濃度C 引入的相對標準不確定度μrel(C)=0.04303

2.2.2 試樣稱量引入的相對標準不確定度μrel(m)

試樣稱量的相對標準不確定度主要來源于分析天平的校準和樣品稱取誤差。稱量采用千分之一天平，由天平檢定證書可得，天平的示值允差為±0.005 g，按均勻分布計算，千分之一天平相對標準不確定度為μ(m1)==0.0028868；樣品稱量5 次，分別為5.012 g、4.988 g、5.006 g、4.994 g、5.000 g，平均稱重5.000 g，其標準偏差為0.009482 g，相對標準不確定度為μ(m2)=所以，樣品稱量的相對標準不確定度為

2.2.3 試樣前處理引入的相對標準不確定度μrel(V)

提取過程需要加入10 mL 乙腈渦旋提取10 min，加入QuEChERS 萃取鹽包離心，混勻，低溫離心10 min，取上清液2.4 mL 至10 mL 離心管中，加入0.6 mL 水混勻，過Captiva EMR-Lipid (300 mg，3 mL)脂肪去除柱，擠干小柱，接收全部洗脫液。其不確定度見表7。

表7 提取過程引入相對合成不確定度μrel(V)

綜上所述，ZAL 提取過程引入相對合成不確定度：

2.2.4 測量重復性引入的相對標準不確定度μrel(χ)

本實驗對樣品含量為10 μg/kg 的樣品進行5 次重復測定，平均含量為()，標準偏差s(x)=標準不確定度為樣品重復引入的相對標準不確定度μrel(χ)=測得結果（見表8）。

表8 重復性實驗引入的不確定度μrel(χ)

2.2.5 添加回收率引入的相對標準不確定度μrel(R)

對添加水平為10 μg/kg 的樣品進行5 次平行重復(n=5)，α-ZAL 和β-ZAL 加標回收率引入的相對不確定度結果見表9。

根據JJG 196-2006《測量不確定度評定和表示》需要校正系統誤差，因此進行t 分布(公式：，μ 期望值，為平均回收率，n=5，s(R)回收率標準偏差考察平均回收率是否具有統計學意義。若t 計t95=2.57，說明顯著差異具有統計學意義，需用回收率校正因子校正測定結果X，否則不必校正。由表9 中可知豬肝中α-ZAL 和β-ZAL 的陽性添加結果都不需校正。

表9 添加回收率引入的相對不確定度

2.2.6 合成相對標準不確定度及貢獻率

根據各分量評定的相對不確定度，合成豬肝中α-ZAL 和β-ZAL 測定相對標準不確定度，并評定各個分量對測定不確定的貢獻率，各影響因素的不確定結果見表10。合成標準不確定度μrel(X)按下式計算：

表10 不確定度評定結果

2.2.7 擴展不確定度的計算

化合物擴展不確定度U 根據如下公式計算：

在置信概率為95%，取擴展因子k=2，豬肝中的α-ZAL 和β-ZAL 的擴展不確定度及結果見表11。

表11 不確定度評估結果

根據各不確定度分量的評定結果，待測液濃度引入的不確定度分量最大，其次為添加回收。待測液濃度引入又分為標準儲備液的配制和稀釋，標準曲線的配制，標準曲線擬合等4 個過程帶來不確定度。其中，占比最大的是標準曲線的擬合，其次為標準曲線的配制，評價結果與王同珍等研究[17-18]基本一致，但又存在一些差異，這與采用前處理方法，選用儀器與器皿精密度及考慮因素的多少均相關。

為完善該方法的質量控制體系，在檢測過程中可加強一下幾個環節的控制而減小不確定度的引入。第一，標準溶液配制主要與量器誤差、量器使用頻次，以及實驗人員的操作水平有關[19-20]。量具的選用，應考慮其誤差的大小，合理利用，減少逐級稀釋過程；第二，標準曲線擬合帶入的不確定度較大，主要是曲線擬合時所選用的C0值的大小決定。在其他條件不變的情況下C0值越大，其曲線擬合的不確定度越小。因而檢測中應根據待測樣品實際含量和儀器的檢測性能，選擇合適梯度濃度的標準工作曲線，可降低其不確定度。如有需要，可采取適當濃度單點校正的方式進行計算，亦可大大降低檢測過程中的不確定度；第三，方法添加回收是檢測過程中質量控制的重要指標，可通過優化前處理過程、規范試驗操作等方法提高加標回收率，減小其平行誤差，減小測量不確定度。

3 結論

本文基于內部建立的QuECHERS-液相色譜-串聯質譜法測定豬肝中玉米赤霉醇含量的方法，分別從待測液濃度、樣品稱量、樣品前處理等方面，對不確定度進行了評價，結果顯示影響不確定度的主要因素是標準溶液的配制、標準曲線擬合和方法的添加回收。因此，針對待測濃度及操作過程中等對不確定度影響較大的因素，在檢測檢驗應用中，需要加強控制，以有助于進一步提高測定結果的可信度。