miRNAs在缺血性腦卒中中的相關研究進展

羅雪顏，楊錫彤 綜述 王光明 審校

大理大學第一附屬醫院基因檢測中心，云南 大理 671000

腦卒中(stroke)是一種嚴重威脅人類身體健康的腦血管疾病，是目前全球第二大死亡率和第三大高致殘率的疾病，在中國腦卒中比例呈現年輕化并逐年上升的趨勢，已成為我國首位致殘和致死原因[1]。腦卒中分為缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)和出血性腦卒中(hemorrhagic infarction，HI)，IS是由于大腦的血液供應中斷導致腦組織缺氧和營養物質短缺而引發的血管堵塞，最終導致腦組織缺血、缺氧及神經功能障礙。目前的研究發現IS是腦卒中的主要類型，約占腦卒中85%以上[2]。目前，輔助監測疾病進展和預測未來事件的診斷工具和生物標記物有限仍然是腦卒中醫學領域的主要挑戰。因此，盡早地明確IS發病機制并及時進行干預，減少IS患者人數是預防腦卒中的關鍵。

微小RNA(miRNAs)為一種單鏈非編碼RNA，目前有研究表明miRNA作為IS重要的調控因子，參與缺血性神經組織炎癥反應的發生和調控，對IS的神經保護和新生血管生成具有潛在應用價值。目前對腦缺血再灌注損傷的研究已經提升到了基因分子水平，miRNAs是十分重要的基因水平調控因子，可以通過分子靶基因和目的基因相關聯來體現IS的表達變化。此外，miRNAs在血液樣本中便于檢測且趨于穩定，可作為早期生物學標志物，為IS的預防、診斷和預后提供參考。本文就miRNAs的分子生物學特征在IS中的作用機制以及生物學應用研究進展進行綜述。

1 miRNAs的分子生物學特征

miRNAs是由20～25個核苷酸組成的小型非編碼RNA，通過完全或不完全堿基互補配對原則與特定靶基因的3'-非翻譯區或5'-UTR結合，抑制miRNAs的翻譯或直接降解特定的miRNAs，在基因轉錄調控和生物體正常發育過程中發揮重要的作用[3]。miRNAs可以調節信使RNA(mRNA)中的“堿基對互補序列”，特別是通過“翻譯抑制”導致基因活性受損。還參與調節IS危險因素的分子，這些分子參與IS的基本病理生理過程，即細胞周期控制、細胞代謝、細胞凋亡和免疫反應等。此外，miRNAs還參與神經系統疾病、心血管疾病、造血障礙、炎癥反應等多種疾病的發生和預后。尤其是miRNAs參與IS后新生血管生成和神經元損傷后保護，能較早的反映IS患者的病理生理變化。

2 miRNAs與IS的相關性

研究表明IS很大程度是由動脈粥樣硬化引起的，在IS發病后，由于腦組織缺乏葡萄糖和缺氧導致缺血性神經功能缺損，IS中異常表達的miRNAs與神經元損傷后保護、炎癥因子釋放減少以及調節小膠質細胞活化等密切相關[4]。大腦中的免疫細胞和小膠質細胞被激活后誘發初級炎癥反應，之后它們通過受損的血腦屏障介導外周免疫細胞進入腦實質，加劇炎癥反應。機體會產生一些miRNAs通過減少神經元凋亡、減少炎癥因子的釋放來減輕炎癥反應，從而發揮神經元保護作用。越來越多的研究表明，miRNAs是血管內皮細胞生物學和血管生成的重要決定因素，也是IS發病機制的重要因素[5]。此外，IS后細胞膜通透性改變出現腦水腫，miRNAs可通過不同通路保護神經元，抑制腦組織水腫。IS患者容易患上認知異常、癡呆、阿爾茨海默氏病、抑郁癥等疾病，極大地加重了患者的生活負擔。與其他缺血機制中討論的miRNAs相似，血管通暢有助于缺血區血供的恢復，減少腦梗死面積是治療缺血性腦損傷最有效的方法，因此增加保護性miRNAs并誘導抗炎性miRNAs可以有效減少缺血性腦損傷，有助于患者的臨床康復。

3 miRNAs在IS中的調控作用

miRNAs作為轉錄后基因沉默的重要媒介，在大腦發育的生理學和IS的病理學中均發揮顯著作用。在IS發生后，患者的腦組織會發生缺血缺氧的情況，導致炎癥介質的分泌和炎癥級聯反應的發生，在病程發展過程中會出現氧化應激反應、能量衰竭及興奮性毒性、血腦屏障紊亂和腦水腫等一系列的病理性改變，機體也會產生大量的活性氧等氧化性高的物質誘導神經元凋亡，最終導致繼發性腦損傷[6]。miRNAs作為IS炎癥反應中重要的調控因子，參與缺血神經組織炎癥反應的發生和調控以及IS的神經元保護、新生血管生成。腦缺血/再灌注后小膠質細胞被啟動，在神經炎癥中起雙重作用，M1型小膠質細胞表達促炎性細胞因子，引起繼發性神經元損傷；在腦卒中發作的急性期M2型小膠質細胞表達抑炎性細胞因子，抑制神經炎癥和修復組織，在髓鞘形成和再形成、神經元再生和血管再形成過程中發揮關鍵作用[7]。ZHAO等[8]研究發現來自間充質干細胞的外泌體過度表達miR-223-3P，減少了大腦中動脈閉塞/再灌注模型引起的腦梗死體積，通過抑制小膠質細胞M1極化介導的促炎反應從而減輕腦缺血再灌注損傷，改善神經功能損傷，促進學習和記憶能力。研究表明，mi RNAs在腦缺血后調節氧化劑和抗氧化劑之間的平衡中起著至關重要的作用，mi R-424、mi R-23a-3p和mi R-99a的過表達可減輕氧化應激，在缺血性損傷后保護大腦[9]。此外，IS的直接影響包括能量衰竭和興奮性毒性，在局部缺血期間，谷氨酸的過度釋放和谷氨酸轉運蛋白的轉運失敗導致谷氨酸受體過度活化和興奮性毒性神經元死亡。還有研究表明腦缺血后miR-107表達水平升高和星形細胞谷氨酸轉運蛋白1(GLT1)表達水平降低對IS影響顯著，miR-107表達上調通過誘導IS后GLT-1表達下調而促進興奮性神經毒性[10]。

一些miRNAs與IS誘發的腦水腫有關，腦水腫是腦缺血死亡的獨立預測因子之一，而BBB功能和結構的損害是血管性腦水腫的病理基礎，IS后腦水腫通過增加顱內壓和減少大腦組織內的血液供應而導致生理惡化。IS誘發的腦水腫也可能是血管性的，在生理水平上，腦水腫由內皮功能障礙、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和水通道蛋白(AQP)介導，有研究發現AQP4是miR-29b的靶標，在局部缺血小鼠模型BBB破壞時，miR-29b的過表達顯著減輕了AQP4的表達及腦水腫和梗死體積的減少[11]，這表明與IS后腦水腫相關的miRNAs與AQP表達相關。

IS發生后，神經元發生壞死和凋亡導致細胞死亡,miRNAs通過負向調控促凋亡或抗凋亡基因，在IS后的凋亡中發揮效應。到目前為止，許多miRNAs包括miR-21、miR-25、miR-181c和miR-210作為凋亡的分子，而miR-124、miR-181和miR-29b促進細胞凋亡[12]。miR-339通過靶向FGF9/CACNG2并介導IS的MAPK途徑來促進缺氧誘導的神經元凋亡并損害細胞活力[13]。利用缺血再灌注腦損傷和興奮性毒性神經元死亡的體內外模型，CHEN等[14]發現miR-223是一種神經元保護microRNAs，以保護卒中和其他興奮性毒性神經元疾病中的神經元細胞死亡，與急性IS的發生、腦卒中的嚴重性和短期預后相關。包括miR-181a、miR-497、miR-9、miR-200和miR-124a在內的多種miRNAs通過Bcl-2家族蛋白調節細胞存活，特別是IS后神經元祖細胞中過表達的miR-124a顯著降低并促進了神經元分化[15]。LI等[16]的研究表明，miRNA-451保護神經元免受缺血性損傷誘導的細胞死亡。在小鼠研究中，miR-137通過抑制Src依賴性MAPK信號傳導途徑來減弱氧化、凋亡和炎性途徑，從而對IS的神經元起保護作用[17]。

最近的研究表明，增強新生血管的形成是治療IS的一種有效策略。IS后血管新生促進側支循環，恢復缺血區血供，減少缺血損傷引起的缺血壞死，可有效逆轉神經損傷。GAN等[18]發現miRNAs借助IncRNA作為ceRNA從而調節靶mRNA的表達，進一步影響新生血管生成過程，例如沉默的MEG8通過靶向miR-130a-5p抑制BMEC活力，遷移血管生成。此外，MEG8可以通過miR-130a-5p/VEGFA軸促進IS后的血管生成，從而保護BMEC免受OGD誘導的損傷[19]。另一項研究顯示，在OGD/R誘導的HBMEC中，MALAT1表達增加，上調的MALAT1通過靶向OGD/R條件下的HBMEC中的miR-205-5p/VEGFA信號傳導，促進細胞增殖并在血管生成中起保護作用[20]。這些研究表明miRNAs轉錄后表達的復雜性和多樣性，使其在細胞的生物學過程、神經元的分化發育和保護性血管生成方面具有一定的作用，因此，增加保護性miRNAs并誘導抗炎性miRNAs可以有效減少缺血性腦損傷并有助于臨床康復。

4 miRNAs在IS中的應用

目前，IS的診斷和預后主要依靠放射成像檢測手段，影像學檢測有一定的局限性，并且有較高的費用。因此，需要一種更快速、簡便的急性IS檢測方法。miRNAs是一種小型非編碼RNA分子，在血液樣本中具有易于檢測、趨于穩定、組織特異性較強、平均半衰期較長等優點，在IS發生后短時間內可在血液中檢測到miRNAs表達水平上調或者下調，可依據IS患者miRNAs表達的高低作為IS患者早期的生物學標志物之一。評估IS的早期征兆可判定危險因素以便進一步管理與IS風險直接相關的疾病。

多種miRNAs與IS的發病機制有相關性，包括miR-155、miR-33、miR-144、miR-223和miR-21，其中miR-126、miR-320b已被提出作為IS的潛在預測標志物[21]。利用人源化小鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)模型，ZHAO等[22]研究發現，circ_0072309-miR-100-mTOR調節軸可以減輕IS的癥狀，可能是IS治療潛在的靶標。近年來，血液檢查中生物學標志物miRNAs的發現和使用在急性腦卒中患者中成為一個有吸引力的研究方向。通過采用逐步發現、驗證和復制的方法對miRNAs進行評估，發現miR-125a-5p、miR-125b-5p和miR-143-3p的組合具有顯著的敏感性(85.6%)和特異性(76.3%)，可作為IS生物學標志物之一[23]。miR-223是谷氨酸受體表達和功能的主要調節因子，在神經元存活中起著重要作用，但仍需要大量的研究確定miR-223作為IS診斷的新型生物標志物的臨床應用[24]。據報道，在大鼠模型的缺血/再灌注期間，有部分miRNAs如miR-206、miR-214、miR-223、miR-298、miR-327和miR-494出現過表達[24]，檢測miRNAs過表達可作為預測IS發生的重要手段之一。此外，miRNAs通過與其他基因組，例如蛋白質組和代謝組數據結合起來生成轉錄組數據庫，獲取可用的miRNAs譜。miRNAs與患者的其他臨床信息(例如年齡、治療發作、NIHSS評分、既往高血壓、心臟病和糖尿病等)也可以結合起來用作預后因素，對腦卒中患者的可用電子健康記錄(EHR)進行解釋。

針對IS的治療，到目前為止，重組組織纖溶酶原啟動劑(tPA)是FDA批準的唯一治療IS的藥物，但是，tPA的使用主要受到治療時間窗較短的影響，只能在腦卒中發作后4.5 h內給予。大腦中動脈近端閉塞的患者可以接受血管內干預，但至今，尚無有效的治療方法針對早期不能修復血管的患者[18]。有研究表明miRNAs作為腦血管疾病的靶點成為當前的研究熱點，目前的治療策略主要有以下兩種方向，第一：通過抗miRNAs技術下調高表達的miRNAs，一些miRNAs在IS后表達異常升高，加重缺血后神經損傷、腦梗死面積、炎癥等反應，例如miR-200c、miR-181a等。通過利用抗miRNAs技術(包括miRNAs拮抗劑和miRNAs誘餌打靶法)抑制此類miRNAs減少來減輕IS損傷。第二：通過miRNAs模擬技術上調miRNAs的表達，一些miRNAs對神經元系統表現出明顯的保護作用，提高這些miRNAs的表達可以達到相關的治療作用，例如miR-124a、miR-451a等[2/5]。李文彥等[16]研究發現miRNA-451在小鼠腦缺血再灌注模型中表達下調，通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路降低體外腦缺血再灌注模型的炎癥反應提示miRNA-451可能開發用于腦缺血再灌注治療藥物的靶點。數據表明，鋰通過BDNF-AS/miR-9-5p軸減少IS誘導的細胞凋亡和炎癥，抑制miR-9-5p或miR-128-3p可以顯著降低MCAO誘導的侵襲體積并抑制凋亡反應[26]。通過縫合法建立大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型和MEG8過表達MCAO模型研究發現：miR-130a-5p下調，而MEG8上調后通過miR-130a-5p/VEGFA信號傳導調節IS后血管生成，減輕腦出血[19]。MiR-29b可以損害Bcl-2基因的表達并增加神經元細胞的死亡，通過下調MiR-29b的高表達提示一種針對IS損傷的新治療靶點[24]。然而一些miRNAs的作用機制與之相反，miR-221通過抑制促炎反應來減輕急性IS的腦損傷，上調miR-221的表達可為IS的治療提供了新的靶點[27]。miR-190通過調節Rho/Rho激酶信號傳導而賦予針對小鼠心肌缺血/再灌注模型(ischemia reperfusion，I/R)損傷的保護，上調其表達顯著降低了患有I/R的大鼠的神經學評分、腦含水量、梗塞體積和神經元凋亡，因此，miR-3552有望成為IS大鼠的潛在生物學治療靶點[28]。通過實驗評估，JIN等[29]發現上調的miR-126和miR-130a水平與IS患者的疾病風險、嚴重程度和炎癥性細胞因子水平降低有關，這將有益于開發新的IS治療方向。這些發現證明了miRNAs轉錄后調控的復雜性，可以通過改變其表達對細胞生存或者死亡產生影響。因此，miRNAs作為新的生物標志物和卒中治療干預的潛在靶點具有良好的應用前景。

5 結語

綜上所述，miRNAs因其序列結構和表達方式的多樣性而成為miRNAs的重要調節因子，本文通過闡述miRNAs與IS作用機制的緊密聯系，以便更好地了解IS機制中miRNAs及其靶基因的發現對IS患者預測、診療、預后存在更大的潛在作用。miRNAs及其靶基因參與了IS的新生血管生成、神經元再生和神經保護等，可能作為IS的新型療法而推廣用于臨床試驗，同時，miRNAs作為治療方案的作用被預測為雙刃劍法，miRNAs也有望成為IS的重要預測、診斷和治療靶標。