二氧化鈦納米管在口腔種植領域的應用進展

馬曉晴，黃綺雯 綜述 唐亮 審校

暨南大學口腔醫學院，廣東 廣州 510632

鈦(titanium，Ti)具有良好的生物相容性和優異的力學性能，是一種應用廣泛的牙科植入材料。但鈦具有生物惰性，細菌容易黏附其表面并產生生物膜，增加種植術后并發癥和失敗率。另外，鈦不支持骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和成骨細胞的成骨且會降低成骨速度，導致骨結合不良[1]。近年來對鈦種植體表面的改性已成為該領域研究的熱點。目前對純鈦進行表面改性主要有物理處理、化學涂層、生物涂層和二氧化鈦納米管(titanium dioxide nanotubes，TNTs)修飾等方法。

采用陽極氧化技術制備的TNTs具有低細胞毒性、良好的生物相容性、高功能表面、光催化活性、良好的抗崩解性以及可調節免疫反應等優點[2]。TNTs修飾的鈦種植體能增強成骨細胞功能，實現長期骨整合[3]，此外，TNTs是一種新型的可控藥物釋放系統，具有廣譜抗菌活性，因此TNTs在口腔種植領域具有廣闊的潛在應用前景。本文將從頜骨骨免疫微環境、種植體周圍炎、藥物遞送等方面闡述TNTs在口腔種植領域的應用進展。

1 頜骨免疫微環境

種植體植入后，免疫系統被激活以調節宿主體內的局部微環境，具有良好骨免疫調節性能的骨再生生物材料可以通過調節成骨和破骨行為促進骨免疫平衡。此外，合適的免疫微環境能夠促進骨再生[4]。BAI等[5]報道直徑為15 nm的TNTs能顯著激活血小板，在下調炎癥相關基因的同時上調生長代謝相關基因，促進骨細胞樹突的伸展，為骨再生和骨整合提供良好的骨免疫調節環境。BELTRáN-PARTIDA等[6]認為TNTs可以促進血管內皮細胞的活性，支持更快的臨床骨整合過程。TNTs能負載多種免疫調節細胞因子，調控免疫反應，從而創造良好的骨免疫微環境。

巨噬細胞是免疫反應的先天調節因子，通過將其極化為促炎癥的M1型巨噬細胞或促愈合的M2型巨噬細胞，能產生過量的細胞因子[5]。種植體植入后，促炎的M1巨噬細胞被干擾素-γ(IFN-γ)等細胞因子激活，隨后抗炎的M2巨噬細胞被白細胞介素-4(IL-4)等細胞因子激活，可促進植入物的愈合和長期穩定。GAO等[7]將免疫調節細胞因子IL-4負載到TNTs中，并在TNTs上進行水凝膠涂層，最后將IFN-γ添加到凝膠層，實現快速釋放，該涂層可以在預期的時間內刺激巨噬細胞從M1表型向M2表型的極化，促進M1向M2巨噬細胞平滑轉換，有助于種植體的穩定。HE等[8]將鄰苯二酚基序修飾的甲基丙烯酸酯明膠水凝膠附著在TNTs上，然后將過氧化鈣納米粒子及IL-4負載到水凝膠中制備雙重載藥系統，結果表明釋放過氧化氫的過氧化鈣納米粒子能快速清除金黃色葡萄球菌，且過氧化鈣納米粒子被包埋在水凝膠中后潛在的細胞毒性明顯降低，此外該系統能誘導巨噬細胞的M2表型極化。LI等[9]用聚多巴胺(polydopamine，PDA)將IL-4固定在TNTs上，隨后在TNTs上制備羧甲基殼聚糖水凝膠涂層并結合核心肽序列，發現該涂層不僅可以驅動巨噬細胞向抗炎的M2表型轉換并產生修復性細胞因子IL-10，還能增強激活與MSCs分化相關的信號通路BMP/SMAD/RUNX2。YIN等[10]在TNTs上制備海藻酸鹽/殼聚糖(chitosan，CH)多層膜，指出該涂層能誘導M1巨噬細胞激活BMP6/SMADs和Wnt10b/β-catenin通路，且誘導M2巨噬細胞激活TGF-β/SMADs通路以促進MSC的早期和中期成骨。YANG等[11]利用貽貝激發的PDA將銀離子固定在TNTs上，認為PDA能控制Ag+的過量釋放，降低銀納米顆粒的細胞毒性，并通過細胞反應性釋放Ag+調節巨噬細胞從M1表型極化為M2表型的時間。CHEN等[12]采用電化學陽極氧化法制備載銀納米TNTs，指出控制釋放超低劑量Ag+的載銀TNTs通過抑制PI3K/Akt通路可減少下游效應分子GLUT1的釋放，從而激活自噬效應以控制炎癥。

種植體植入后，術后損傷的組織與其相互作用會產生大量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，ROS通過氧化DNA、脂質和蛋白質破壞細胞并作為信號分子參與細胞生理調控，氧化還原的失衡會導致細胞功能紊亂，破壞細胞穩態[13]。此外，大量的ROS會引起巨噬細胞的聚集和炎癥，長期的炎癥會導致種植體無菌性松動[14]。YANG等[15]將白藜蘆醇負載到TNTs上，指出該涂層能有效消除ROS，抑制NF-κB信號通路的活化，從而抑制炎癥反應，維持骨穩態并促進MSCs的成骨分化。GAO等[16]在鈦合金表面制備PDA和載銀納米TNTs涂層，發現該涂層能夠清除ROS，增強細胞黏附和刺激細胞分化。YANG等[17]指出高糖狀態下細胞產生過量的ROS會抑制細胞黏附和增殖，降低線粒體膜電位，誘導細胞凋亡。與純鈦噴砂表面相比，TNTs表面在糖尿病條件下產生的ROS較少，在體內外表現出良好的生物相容性和成骨能力。此外，TNTs表面通過產生更多超氧化物歧化酶以平衡ROS的表達，避免ROS的過量產生，最終緩解高糖狀態下ROS對成骨的抑制。HUANG等[18]指出TNTs的抗氧化性由上調的叉頭盒轉錄因子FoxO1驅動，FoxO1在MSCs中通過shRNA廢除，因此TNTs能減輕巨噬細胞的氧化應激反應，增加抗炎細胞因子IL-10的分泌誘導M2表型的分化，進一步提高骨免疫力。

2 種植體周圍炎

種植體周圍炎是一種發生在種植體周圍軟硬組織的炎癥性疾病，臨床表現為不同程度的骨組織喪失，伴有種植體周圍袋的形成、探診出血及溢膿[19]。引起種植體周圍炎的因素有：菌斑微生物、牙周炎、咬合過載、種植三維位置欠佳、角化齦不足、種植義齒設計不合理和修復部件松動等[20-21]。持續的感染最終會導致骨結合喪失和種植失敗[22]。目前種植體周圍炎的治療方法分為非手術治療和手術治療，非手術治療主要包括機械清創術、藥物治療、激光治療和抗菌動力治療等[23-24]。TNTs修飾的鈦種植體，主要通過改性、負載生物活性分子或抗菌劑以促進種植體周軟組織封閉、實現抗菌活性等多種功能，預防和控制種植體周感染。

2.1 促進種植體周軟組織封閉 種植體穿齦部分強有力的軟組織整合對種植體的長期成功至關重要，種植體冠部封閉由牙槽骨上的結締組織和交界處上皮組成，結締組織是種植體冠部封閉的重要部分，可限制連接上皮的根尖遷移，保障有效的骨結合[25]。然而，由于口腔細菌生物膜的不良反應，種植體的成功率可能會因為跨黏膜軟組織完整性的損害而受到影響[26]。人牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblasts，HGFs)作為種植體周圍軟組織的主要細胞，分泌含有豐富膠原纖維的細胞外基質，能促進牙齦創面的愈合、修復和再生[27]。XU等[28]在鈦表面制備直徑分別為30 nm、100 nm和200 nm的TNTs，發現直徑為30 nm和100 nm的TNTs均能增強HGFs的黏附、增殖和細胞外基質相關基因的表達，其中直徑100 nm的TNTs可以最大限度地激活HGFs功能，并降低牙齦假單胞菌在穿齦部的黏附，促進軟組織附著，抑制細菌生物膜的黏附，保護牙槽骨。WANG等[29]采用陽極氧化和熱氫化技術制備超親水性TNTs，表明修飾后的表面可以大幅上調黏著斑激酶和磷酸化黏著斑蛋白激酶的表達，HGFs在氫化TNTs的黏附、遷移相對基因表達水平和細胞外基質合成均增強，而且其誘導了黏著斑激酶活化和整合素介導的黏附，提示陽極氧化和氫化修飾的超親水納米結構可以提高HGFs的生物活性并能促進結締組織再生。

天然牙里牙齦纖維垂直插入牙骨質中，以獲得良好的附著，而種植體周圍的結締組織纖維與牙根表面平行或成圓周排列，此結構不利于種植體周圍的軟組織封閉及力的傳導。TNTs可以通過促進垂直纖維的插入以增強種植體周圍的軟組織附著，使種植體周上皮保持在修復體和種植體之間的垂直水平[30]。HOU等[21]用聚合物滲透的無定型TNTs制作類牙周膜韌帶樣種植體周圍韌帶，結果顯示該結構能增加18%以上的骨結合，并將種植體傳導至周圍骨組織的有效應力降低30%，防止超負荷引起的骨吸收。CHEN等[31]應用電泳融合(electrophoretic fusion，EPF)方法將Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)垂直融合成納米管陣列(TNTs-ColEPF)，指出具有垂直Col-Ⅰ表面的TNTs在刺激血小板介導的成纖維細胞募集的同時錨定成纖維細胞來源的Col-Ⅰ形成垂直的膠原集合體，此外該涂層表面對促炎性腫瘤壞死因子-α的釋放有輕微的促進作用，但對組織再生因子如PDGF-AB、轉化生長因子-β和血管內皮生長因子的刺激作用顯著，說明TNTs-ColEPF表面通過建立牢固的軟組織密封，能夠減少種植體的并發癥。當TNTs-ColEPF延伸到種植體上時，可以獲得堅固而靈活的種植體牙周韌帶狀懸浮物，通過EPF附著在鈦表面的膠原蛋白可用于預防和作為跨黏膜種植體的抗炎治療。TNTs-ColEPF表面能抑制上皮細胞的初始黏附，其與膠原纖維的垂直黏附可防止上皮細胞向下生長[32]。

2.2 抗菌性 IM等[33]用電噴霧沉積法在TNTs上沉積聚乳酸-乙醇酸共聚物，并在其上負載四環素納米顆粒以應對種植體感染等問題，結果表明四環素納米顆粒包裹的TNTs具有抗金黃色葡萄球菌活性和前成骨細胞MC3T3-E1的生物相容性，TNTs的成骨活性被保留。與傳統抗生素相比，抗菌肽的殺菌機制更快且細菌極難產生抗藥性[34]。KAZEMZADEH-NARBAT等[35]在TNTs、磷酸鈣涂層和磷脂層的垂直三層結構上浸漬一種高效的抗菌肽，發現該涂層對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有良好的抗菌活性且對成骨細胞MG63無細胞毒性。FENG等[36]將穿心蓮脂負載到TNTs中，結果顯示穿心蓮內酯負載的TNTs能顯著地對抗葡萄球菌形成的外層生物膜以控制感染。

3 藥物遞送

種植術后感染常常會導致種植失敗，傳統的給藥方式存在許多缺點和局限性，如生物分布性差、治療效率低、副作用大、藥物溶解性差以及容易造成細菌耐藥性等，采用局部給藥方式能夠提高局部用藥部分的藥物濃度，有效地控制感染的發生[37]。TNTs作為新型載藥系統，其尺寸、幾何構型及藥物釋放方式可以通過不同方法調控，且TNTs具有高比表面積和高載藥量等優點，在藥物釋放方面具有廣闊的應用前景[38]。目前主要使用物理吸附、電泳沉積和磁控濺射等多種技術將具有抗菌和成骨作用的元素或分子負載到TNTs中以促進骨整合及控制感染，但TNTs的突釋行為會導致局部藥物濃度過高而引起細胞毒性，不利于周圍組織健康，可通過改變納米管的尺寸、表面修飾、聚合物包封及刺激響應等方法延緩藥物的釋放[39]。目前關于納米管尺寸及表面修飾方法以控制藥物釋放的研究已有大量報道[40-42]，本文主要從聚合物包封和刺激響應兩方面進行闡述。

3.1 聚合物包封 RAHNAMAEE等[43]在TNTs上負載萬古霉素并將還原石墨烯(reduced graphene oxide，RGO)和CH組裝在TNTs上形成多功能涂層，研究純鈦組、TNTs組、TNTs/CH組、TNTs/RGO組及TNTs-RGO/CH組的藥物釋放行為，結果表明RGO對萬古霉素的釋放有輕微的抑制作用，培養20 d后TNTs組藥物完全釋放，而TNTs/CH組和TNTs-RGO/CH組的累積釋放率分別為87%和88%，TNTs/CH組和TNTs-RGO/CH組的藥物持續釋放至31 d。HASHEMI等[44]在TNTs上負載糖尿病藥物二甲雙胍，并在TNTs上旋涂CH以形成具有可持續藥物凝膠特性的表面，結果顯示與對照組相比，CH包覆的TNTs藥物釋放時間由3 d延長至20 d，突釋行為由85%降低至7%，實現藥物可持續釋放。

3.2 載藥刺激性反應釋放策略

3.2.1 pH響應性釋放策略 細菌感染后的局部微環境為弱酸性(pH≤6.0)，低于正常組織(pH=7.4)，因此可利用細菌感染部位和正常組織之間的pH差作為觸發信號開放藥物輸送平臺[45]。YIN等[10]將TNTs制備成“潘多拉盒子”，然后將抗菌肽HHC36置入盒內并用pH響應的分子門聚甲基丙烯酸封閉，該分子門在生理條件下膨脹關閉延緩抗菌肽的釋放，但在細菌感染時(pH≤6.0)時分子門坍塌打開以釋放抗菌肽殺菌，與對照組相比，實驗組50%和90%釋放時間分別增加了近20倍和7倍，即72 h和168 h。TAO等[46]將骨形態發生蛋白2負載在TNTs上，用海藻酸雙醛慶大霉素和CH組成pH響應的多層膜模擬生理環境(pH=7.4)和感染微環境(pH=5.8)進行藥物釋放行為研究，結果表明當pH=7.4時，僅有17.0μg慶大霉素從多層膜中釋放，而在pH=5.8的條件下，釋放的慶大霉素達38.1μg。關于藥物長期分布方面，在pH=7.4和pH=5.8中培養10 d后，該多層膜中分別釋放出約44.0和130.3μg慶大霉素，以上結果均表明，該多層具有較好的pH響應性。

3.2.2 酶響應性釋放策略 透明質酸具有高度親水性，有助于蛋白排斥及抗微生物定植。臨床病原菌尤其是金黃色葡萄球菌在感染階段會分泌高濃度的特異性酶，如透明質酸酶(hyluronidase，HAase)和糜蛋白酶[47]。YU等[48]在負載去鐵胺的TNTs上構建透明質酸-慶大霉素偶聯物(hyaluronic acid-gentamicin conjugates，HA-Gen)及CH聚電解質多層膜，指出HA-Gen對細菌具有抗黏附能力，可通過細菌定制期間分泌的HAase降解，釋放出慶大霉素片段殺滅細菌，且該涂層在無HAase的情況下，去鐵胺釋藥曲線穩定適中，而在外源性HAase的作用下，底物在最初12 h內出現突發性釋放，24 h內幾乎完全釋放，說明該涂層可以實現去鐵胺的突發釋放和按需投放。YUAN等[49]以含有萬古霉素的TNTs為載體，在鈦基底上制備由多巴胺修飾的HA和3,4-二羥基肉桂酸修飾的CH組成的鄰苯二酚功能化多層膜，于三種濃度下(0.01 mg/mL、0.05 mg/mL和0.5 mg/mL)觀察該涂層的藥物釋放行為，結果表明在沒有HAase的情況下，對照組釋放量達75%，而實驗組釋放量不到10%，此外實驗組的萬古霉素釋放度在12 h后減慢，在72 h后釋放峰值約達90%，說明該涂層具有快速酶響應性，避免了正常組織中不必要的毒副作用。

4 總結

目前，國內外學者對TNTs在口腔種植領域應用方面已經做了大量的研究，通過改性方法對TNTs的復合處理越來越受到重視。TNTs具有良好的生物相容和局部藥物釋放能力，可以改善骨免疫條件、促進成骨和改善軟組織封閉，適當功能化的TNTs能夠解決骨結合不良、炎癥和感染等問題。生物活性涂層TNTs常與其他生物活性元素或殺菌劑結合在一起，以實現骨整合和抗菌活性等多種功能。但是，TNTs作為抗菌劑載體，仍存在藥物難以控制突釋行為及細菌耐藥性等問題，需要進一步尋找抗菌活性和再生能力之間平衡的方法。