小檗堿對被動吸煙大鼠血清血管炎性因子影響的研究*

于曉明 卿力東

1 江西中醫藥大學,江西省南昌市 330006; 2 江西中醫藥大學研究生院

吸煙是最為常見的個人不良嗜好之一，相關流行病學調查顯示，目前國內吸煙人數已經超過3億，15歲及以上人群吸煙率為26.6%，其中男性成年人口吸煙比率更是高達50.5%，吸煙導致我國每年有100多萬人失去生命[1]。現代醫學研究證明吸煙是動脈粥樣硬化重要危險因素[2]，吸煙所導致的血管炎性反應可能是動脈硬化的啟動因素并且其可參與動脈粥樣硬化的整個進程[3]。血清超敏C反應蛋白(hs-CRP)、白細胞介素-6(IL-6)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)是與動脈粥樣硬化相關的重要血管炎性因子，本研究團隊通過對分組大鼠進行持續不同時間的被動吸煙，與對照組比較，觀察持續不同時間的被動吸煙對大鼠血清hs-CRP、IL-6、MMP-9等血管炎性因子的影響，并觀察灌服小檗堿溶液對大鼠血清hs-CRP、IL-6、MMP-9的影響，從而探索吸煙導致動脈粥樣硬化的病理機制，同時也為小檗堿防治動脈粥樣硬化提供初步實驗支持。

1 材料和方法

1.1 實驗一

1.1.1 實驗材料：(1)動物：實驗選用清潔級健康雄性SD大鼠9只，體質量(200±20)g，6～8周齡，由江西中醫藥大學動物實驗中心提供。(2)主要儀器和試劑：香煙煙霧自動發生器、被動吸煙玻璃箱(50cm×50cm×70cm)、無毒塑料鼠盒、不銹鋼絲籠蓋、香煙(紅雙喜牌卷煙，焦油含量每支11mg，煙堿含量每支1mg)、塑料瓶飲水器、酶聯免疫吸附(ELISA)法測定hs-CRP、IL-6、MMP-9試劑盒(試劑盒購自上海豐壽實業有限公司)。

1.1.2 實驗方法：按吸煙持續時間不同將實驗大鼠隨機均分為：吸煙長時間組(n=3)、吸煙短時間組(n=3)、非吸煙對照組(n=3)。大鼠采用同等方式飼養于動物房，實驗動物的飼養環境溫度控制在(23±1)℃，相對濕度控制在40%～70%，煙霧暴露過程中箱內濃度維持在20%，供給大鼠標準動物飼料(購買于江西中醫藥大學實驗動物中心)和水, 水可自由取食。吸煙長時間組：大鼠于裝置內給予煙霧暴露，每周熏煙6d，每天上、下午各1次，每次使用香煙15支，時間控制在每次1.5h。吸煙短時間組大鼠于裝置內給予煙霧暴露，每周熏煙6d，每天上、下午各1次，每次使用香煙5支，時間控制在每次0.5h。非吸煙對照組同時放至相同裝置內給予空氣暴露。共建模6周，之后從腹主動脈采血，離心，分裝血清，-80℃凍存。用ELISA法測定hs-CRP、IL-6、MMP-9濃度。

1.2 實驗二

1.2.1 實驗材料：(1)動物：實驗選用清潔級健康雄性SD大鼠18只，體質量(200±20)g，6～8周齡，由江西中醫藥大學動物實驗中心提供，隨機分為吸煙長時間灌藥組(n=9)、吸煙長時間組(n=9)。(2)主要儀器和試劑：同實驗一。

1.2.2 實驗方法：將實驗大鼠隨機均分為吸煙長時間組和吸煙長時間灌藥組，分別進行如下處理：吸煙長時間組：SD大鼠于裝置內給予煙霧暴露，每周熏煙6d，每天上、下午各1次，每次使用香煙15支，每支香煙點燃15min后換煙，每次1.5h。吸煙長時間灌藥組:SD大鼠于裝置內給予煙霧暴露，每周熏煙6d，每天上、下午各1次，每次使用香煙15支，時間控制在每次1.5h，同時，每天給大鼠予小檗堿溶液按60mg/(kg·d)的劑量進行灌胃。實驗動物的飼養環境溫度控制在(23±1)℃，相對濕度控制在40%～70%，供給大鼠標準動物飼料(購買于江西中醫藥大學實驗動物中心)和自來水,水可自由取食。共建模6周，之后腹主動脈采血，離心，分裝血清，-80℃凍存。用ELISA法測定hs-CRP、IL-6、MMP-9濃度。

2 結果

2.1 實驗一結果 hs-CRP含量在吸煙長時間組中的含量低于非吸煙對照組和吸煙短時間組(P<0.05)，但在非吸煙對照組和吸煙短時間組之間無差異(P>0.05)；IL-6含量在吸煙長時間組中的含量高于非吸煙對照組和吸煙短時間組(P<0.05)，但在非吸煙對照組和吸煙短時間組之間無差異(P>0.05)。MMP-9含量在吸煙長時間組中的含量高于非吸煙對照組和吸煙短時間組(P<0.05)，但在非吸煙對照組和吸煙短時間組之間無差異(P>0.05)。見表1。

表1 被動吸煙對大鼠血清hs-CRP、IL-6、MMP-9水平影響結果

2.2 實驗二結果 統計分析得出，與吸煙長時間組相比，hs-CRP含量在吸煙長時間灌藥組中無顯著差異(P>0.05)，但IL-6 和MMP-9含量在吸煙長時間灌藥組中均有降低，有顯著差異(P<0.05)。見表2。

表2 小檗堿干預對長時間吸煙大鼠血清hs-CRP、IL-6、MMP-9水平影響

3 討論

吸煙可以分為主流煙和側流煙，主流煙是抽吸時通過煙柱直接進入口腔的氣流，而側流煙是在沒有抽吸時，從燃著的煙絲直接進入空氣的氣流，二者成分本質相同，只是存在量的差別[4],故而采用被動吸煙的動物實驗研究吸煙的致病作用具有切實可行性，此外，主動吸煙的動物模型難以建立，也是本研究采用被動吸煙進行觀察的一大原因。

吸煙是心腦血管疾病的重要致病因素，研究發現吸煙對動脈粥樣硬化的危險性可隨著吸煙量增大而增加[5]。尼古丁是煙草中主要有毒物質，其可以活化炎性細胞而促進炎癥反應[6]。在體外實驗研究中, 發現尼古丁可促使人臍靜脈內皮細胞釋放IL-6增多, 從而導致內皮損傷、炎癥與纖溶活性紊亂。

MMP-9是基質金屬蛋白酶家族中的一員，是分解細胞外基質和基底膜過程中的主要物質[7]，細胞外基質和基底膜的降解為炎癥細胞及因子進入組織打開門徑。MMP-9參與動脈粥樣硬化斑塊的發生、發展，且可能成為動脈粥樣硬化斑塊性質及發生腦梗死風險的預測指標[8]。IL-6是一種促炎細胞因子，因其在心腦血管事件中潛在的診斷和預測價值而越來越受到醫學界關注。IL-6是引起急性期反應的信號，其不僅能誘導肝臟細胞產生CRP，也能誘導促炎因子IL-23、IL-17的釋放，從而進一步促進炎癥反應[9]。在腦梗死急性期時，血清IL-6表達也會顯著升高，加重對腦組織的損害，從而對疾病發展產生不良影響[10]。綜合以上研究可知，MMP-9、IL-6在引起血管壁損傷、促使動脈粥樣硬化和腦梗死病變中均具有較為肯定的推動作用，本實驗發現被動吸煙能夠時間依賴地使大鼠血清IL-6、MMP-9等血管炎性因子水平升高，提示這可能是吸煙導致動脈粥樣硬化的重要機制。

隨著對吸煙致病作用研究的增多，有學者在研究吸煙對急性心肌梗死患者的影響時，卻發現吸煙患者的預后更好，此現象被稱之為“吸煙悖論”[11-12]。中醫古代醫家在認識到吸煙危害人體健康的同時，也發現了煙草煙氣的某些治療作用，如清代醫家吳儀洛認為煙屬辛溫之品，能行能散，可以宣通陽氣，避穢殺蟲，但如果用之代茶飲，長期使用，則火氣熏灼、耗傷陰血、損耗壽命[13]。本研究發現被動吸煙可以降低吸煙長時間組大鼠血清中hs-CRP含量，提示煙作為中藥本草，確實存在一定的藥理作用，但煙草中同時存在大量有毒物質，因此應當加強對吸煙中具有藥用價值成分的研究，此外，本實驗吸煙時間長短和臨床中吸煙者時間比較具有相對性，且超長期吸煙者模型難以建立，因此超長期吸煙對血清中hs-CRP含量的影響還需做進一步的研究和觀察。

中醫學研究認為，吸煙時煙霧具有火熱之性，火熱可以直接灼傷脈絡，亦可灼津成痰，熱與痰結可以形成痰熱，阻塞脈道可形成瘀血，痰熱、瘀血結于損傷脈道可以導致脈痹，即動脈粥樣硬化，病情進一步發展則可以導致中風、胸痹等疾病，在此病變過程中，火熱灼脈是脈痹的病機關鍵所在[14-15]。《素問·四氣調神大論》言道：“圣人不治已病治未病，不治已亂治未亂”，積極戒煙，減少生熱之源，或早期使用清熱瀉火的藥物均可預防動脈粥樣硬化的形成。當前對吸煙促使動脈粥樣粥樣硬化和腦梗死的干預，主要在于勸誡患者戒煙以祛除致病之因，但對于難以戒煙者或吸煙已然造成病理影響尚無針對療法，此方面研究目前也相對較少。辨證論治是中醫學的特色和優勢之一，通過對吸煙所致病理改變和臨床癥狀進行辨證分析治療，以期干預吸煙促使動脈粥樣硬化進程，有利于預防動脈粥樣硬化的加重以及腦梗死的發生，這也是中醫學治未病中既病防變、防微杜漸思想的體現。然而，相當比例具有吸煙病因的動脈粥樣硬化患者可無臨床癥狀表現或有辨證參數不足的情況，從而不利于辨證的準確性，論治時亦缺乏療效觀察指標。根據吸煙所致的火熱灼脈病機，從火熱論治動脈粥樣硬化時，可以在宏觀辨證的基礎上結合微觀辨證，參考血清IL-6、MMP-9水平，有利于發揮宏觀辨證的整體性優勢和微觀辨證的客觀性優勢，提高辨證治療的準確性。

黃連始載于《神農本草經》,列為上品，該藥味苦性寒, 歸心、脾、 胃、肝、膽、大腸經, 具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。黃連的有效成分為小檗堿，隨著現代藥理研究發現小檗堿具有降血脂、降血糖、降血壓、抗心律失常、擴張冠狀血管等作用。張金霞等[16]研究發現小檗堿可能通過干預CCL2、HMOX1、MMP-9等關鍵靶點，調控流體剪切力以及IL-17、TNF等信號通路發揮干預頸動脈粥樣硬化的作用。劉琴等[17]研究發現小檗堿能夠減輕高糖及高脂引起的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊沉積并改善斑塊的脆弱性。高脂血癥是動脈粥樣硬化的主要危險因素之一，譚文倩等[18]通過實驗研究發現低劑量小檗堿可以促進正常飲食小鼠腸道短鏈脂肪酸和膽汁酸產生，降低正常飲食小鼠血清三酰甘油水平。本實驗發現與吸煙長時間組比較，灌服小檗堿的吸煙長時間組大鼠血清中IL-6、MMP-9水平均較低，兩組對比具有顯著性差異。因此，提示灌服小檗堿溶液可以抑制被動吸煙大鼠血清IL-6、MMP-9水平的升高，從而可以起到預防和治療動脈粥樣硬化的作用。

本項研究發現被動吸煙能夠時間依賴地使大鼠血清IL-6、MMP-9等血管炎性因子水平升高，提示這可能是吸煙導致動脈粥樣硬化的具體病理學機制之一。灌服小檗堿溶液可以抑制被動吸煙大鼠血清IL-6、MMP-9水平的升高，從而可以起到預防和治療動脈粥樣硬化的作用，同時也為中醫探討吸煙導致的火熱灼脈理論及清熱瀉火法治療動脈硬化提供實驗室證據。后期筆者將以本實驗為基礎進一步開發以黃連為主藥的中成藥的藥效學研究。