黃曲霉毒素檢測方法的研究進展

◎ 袁京磊

（平邑縣檢驗檢測中心，山東 平邑 273300）

黃曲霉毒素（AFT）主要是由黃曲霉、寄生曲霉等霉菌產生的一類化學結構類似的毒性代謝產物，它們廣泛存在于土壤、動植物、各種堅果中，特別容易污染花生、玉米、稻米等糧食，是霉菌毒素中毒性最大的一類霉菌毒素[1]。最常見的6種AFT分別是黃曲 霉 毒 素 B1（AFB1）、B2（AFB2）、G1（AFG1）、G2（AFG2）、M1（AFM1） 和 M2（AFM2）， 其 中AFB1的急性毒性、致癌性、致突變性、致畸性在所有的真菌毒素中均居首位。AFT是目前發現的較強的致癌物質，主要誘發肝癌，嚴重威脅人類的健康。防止AFT污染的策略主要有防霉、去毒（物理去及化學去除法、生物脫毒方法）和檢測，其中對食品中AFT進行檢測是防止AFT中毒的重要一環，也是保障食品安全的重要措施。

1 高效液相色譜法

目前，國標法主要使用高效液相色譜（HPLC）對食品中的AFT進行檢測，其原理是將試樣中的AFT提取后，再經凈化柱凈化去除脂肪、蛋白質、色素及碳水化合物等干擾物質，再經液相色譜分離、熒光檢測器檢測、外標法定量等步驟，實現對AFT準確的檢測。姚譽陽等[2]建立了QuEChERS-HPLC-柱后光化學衍生法測定糧谷類食品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的分析方法；樣品經過1%甲酸-乙腈提取，MgSO4+C18+PSA凈化，HPLC-柱后光化學衍生化法檢測，AFB1、AFG1和AFB2、AFG2線性范圍分別為 0.5 ～ 20 μg·L-1、0.125 ～ 5 μg·L-1，檢出限為0.1 ～ 0.3 μg·kg-1，定量限為 0.3 ～ 1.0 μg·kg-1，加標回收率為86.4%～97.8%，相對標準偏差（RSD）為2.9%～6.3%，該方法可用于糧谷類食品中AFT的大批量檢測。劉穎等[3]建立了同步檢測飼料中AFB1、玉米赤霉烯酮（ZEN）及嘔吐毒素的高效液相色譜法；樣品用乙腈-水提取，過三合一免疫親和柱凈化，用甲醇洗脫，洗脫液經50 ℃濃縮氮氣吹干后用50%甲醇-水復溶，采用HPLC串聯光化學衍生器、熒光檢測器和紫外檢測器進行檢測；其中，檢測AFB1標準品的線性范圍為2.5～50.0 ng·mL-1，平均加標回收率為81.2%～92.3%，RSD為4.3%～9.5%；該方法具有準確度和精密度高、穩定性好的特點，可用于飼料中AFB1、ZEN及嘔吐毒素的同步檢測。

2 可視化檢測方法

可視化檢測方法能夠直觀地觀察到檢測結果，無需借助復雜的儀器設備，具有簡單、快速、結果可視化等優勢。目前，已有應用可視化檢測方法實現AFT檢測的報道。ABNOUS等[4]基于CRISPR-Cas12a、滾環放大和納米金的催化活性，建立了高靈敏度檢測AFM1的比色適配體傳感器；在AFM1存在的情況下，CRISPR-Cas12a會失活，添加T4 DNA連接酶和phi29 DNA聚合酶后，納米金表面會形成大的單鏈DNA結構；因此，加入4-硝基苯酚后，顏色仍為黃色；當不存在AFM1時，由于CRISPR-Cas12a激活和引物消失，納米金表面沒有形成大的DNA結構，樣品的顏色變為無色；該方法對AFM1具有高選擇性，檢測限（LOD）低至0.05 ng·L-1，并成功用于牛奶樣品中AFM1的檢測。TANG等[5]設計了一種使用智能手機讀取比色信號的快速檢測AFB1的紙基微流控芯片，實現了對AFB1的可視化檢測，該方法的LOD和定量限分別為9.4 ng·mL-1、12.00 ng·mL-1。

3 電化學檢測方法

電化學檢測方法在食品安全檢測中有著廣泛的應用，能夠實現對食品中有害成分高靈敏、準確的檢測。近年來，隨著適配體研究的深入，基于適配體和電化學的新型檢測方法在AFT檢測中的應用越來越多。惠媛媛等[6]基于還原氧化石墨烯（RGO）構建了用于AFM1檢測的電化學適配體傳感器；采用紅棗汁還原氧化石墨烯（GO）制備RGO，通過滴涂法將RGO修飾在玻碳電極（GCE）表面，利用電沉積法將納米金修飾在RGO/GCE上，AFM1的適配體（Apt）通過Au-S鍵固定在AuNPs/RGO/GCE電極表面用于靶標AFM1的捕獲；當AFM1存在時，AFM1與適配體特異性結合形成AFM1-Apt復合物，該復合物阻礙了電子的傳遞，導致電化學信號減弱，該方法的檢測范圍為1×10-7～ 5×10-4ng·mL-1，LOD為 3.3×10-5pg·mL-1。GUO等[7]基于聚4-乙烯基吡啶、碳化鈦和羧化氧化石墨烯復合材料構建了一種用于檢測AFB1的獨特開/關轉換電化學適配體傳感器，用于檢測酸性環境中的AFB1，該方法具有較寬的檢測范圍（0.01～50 ng·mL-1）和較低的LOD（3 pg·mL-1）。SINGH等[8]設計了一種基于氧化錳納米粒子的電化學免疫傳感器，實現了對AFB1的檢測；使用電泳技術在氧化銦錫表面上覆蓋了一層氧化錳納米粒子薄膜，用來固定AFB1抗體，再用差分脈沖伏安法選擇性檢測AFB1；檢測范圍為1 ～ 10 μg·mL-1，LOD為 0.54 pg·mL-1；對玉米提取物進行加標回收實驗，回收率為98.6%。

4 熒光分析法

熒光分析法是指利用某些物質被紫外光照射后處于激發態，激發態分子經歷一個碰撞及發射的去激發過程所發生的能反映出該物質特性的熒光，可以進行定性或定量分析的方法，熒光分析法在AFT的檢測中應用也較多。JIANG等[9]構建了雙色持續發光納米傳感器，用于同時和無自發熒光測定AFB1和ZON；通過制備功能性雙色持續發光納米粒子與Fe3O4磁性納米粒子，并使用具有高親和力和特異性的適配體作為識別工具，實現對食品樣品中AFB1和ZON的高靈敏度和選擇性檢測，LOD分別為0.29 pg·mL-1和0.22 pg·mL-1，加標回收率分別為93.6%～103.2%和94.7%～105.1%。QIAO等[10]基于AFM1/適配體復合物導致熒光信號變化的原理，設計了一種快速、簡單檢測牛奶中AFM1的方法；首先，將AFM1的適配體用羧基熒光素修飾，它的互補DNA（cDNA）用羧基四甲基羅丹明淬滅基團修飾；在沒有AFM1的情況下，適配體與cDNA雜交，由于適配體的熒光團靠近cDNA上的淬滅基團，導致適配體熒光淬滅；當AFM1存在的情況下，AFM1適配體復合物的形成誘導了適配體的結構轉換，導致cDNA釋放，從而產生熒光信號；該方法的線性響應范圍為1～100 ng·mL-1，LOD為0.5 ng·mL-1；對牛奶樣品進行加標回收實驗，回收率為93.4%～101.3%。

5 酶聯免疫吸附測定方法

酶聯免疫吸附測定（ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性和定量檢測方法，在疾病診斷和食品安全檢測中有廣泛的應用。張寧等[11]結合間接競爭反應機制，運用ELISA方法建立了快速檢測AFT的改進方法，該方法的半抑制濃度（IC50）＜ 0.1 μg·L-1，加標回收率為 67% ～ 116 %，靈敏度達到0.03 μg·L-1。WANG等[12]建立了一種間接競爭性ELISA方法，用于快速檢測地甲蟲、蟑螂、蠶和蚯蚓中的AFB1；該方法的IC50為0.092～0.135 ng·mL-1，LOD為0.008～0.020 ng·mL-1；對實際樣品進行檢測，檢測結果與液相色譜結合串聯質譜檢測的結果具有良好的相關性。YAN等[13]基于生物素化納米抗體Nb26和鏈霉親和素偶聯的辣根過氧化物酶設計了一種生物素-鏈霉親和素擴增的ELISA方法，用于靈敏、快速地檢測谷物中的AFB1；該方法的IC50值為0.21 ng·mL-1，檢測時間為50 min，可節省多達98%的抗體；應用該方法檢測兩種谷物樣品中的AFB1，檢測結果與HPLC的結果基本一致。

6 其他檢測方法

除以上檢測方法外，其他檢測AFT的方法主要有生物傳感器、免疫傳感器及熒光共振能量轉移（FRET）、試紙條等，均能實現對AFT的快速、準確檢測。HAMAMI等[14]設計了防污PEG/納米金復合物的生物傳感器，實現了對牛奶中AFM1的靈敏檢測，檢測范圍為 20 ～ 300 pg·mL-1，LOD低至 7.14 pg·mL-1。LI等[15]開發了一種超靈敏檢測牛奶中AFM1殘留的免疫傳感器；LOD為 0.018 6 ng·mL-1（18.10 ng·kg-1），線性范圍為0.003～0.81 ng·mL-1，對牛奶樣品進行加標回收實驗，平均回收率為79.6%～112.5%，RSD為6.7%～13.3%。WU等[16]基于FRET構建了一種用于檢測AFB1的新型上轉換納米材料適配體傳感器；線性范圍為 0.2 ～ 500 ng·mL-1，LOD為 0.028 ng·mL-1；該方法對花生油和小麥樣品進行加標檢測的精密度和準確度與HPLC沒有明顯差異。LI等[17]開發了一種基于時間分辨熒光微球免疫層析試紙條，用于快速定量檢測牛奶及其制品中的AFM1；該試紙條的線性范圍為 0.05 ～ 2.0 ng·mL-1，IC50為 0.204 ng·mL-1，靈敏度為0.019 ng·mL-1，加標回收率為84.6%～119.0%；檢測牛奶樣品中AFM1的結果與超高效液相色譜-串聯質譜的結果基本一致，可用于定量檢測牛奶中的AFM1。

7 結語

隨著適配體技術的不斷發展，以適配體為識別工具的快速檢測方法將在AFT的檢測中得到廣泛的應用，尤其是基于適配體的電化學傳感器、生物傳感器、適配體傳感器等，將在AFT快速檢測中發揮越來越重要的作用。