戊唑醇-三唑酮雙模板分子印跡聚合物在煙葉農殘檢測中的應用

景聯鵬，顧麗莉，師君麗，李增良，楊發容，李國棟

（1 昆明理工大學化學工程學院，云南 昆明 650500；2 云南省煙草農業科學研究院，云南 玉溪 653100）

戊唑醇和三唑酮屬于三唑類殺菌劑，因其低毒、殺菌廣譜和活性高等特點被廣泛應用于小麥、蔬菜和煙草等農作物的病蟲防治[1]。由于戊唑醇和三唑酮用量大，化學性質穩定，不易降解，半衰期長，因此在使用過程中可能對動植物及環境造成危害，從而嚴重威脅人類健康和生態安全[2-3]，故而對農產品和環境中戊唑醇和三唑酮的殘留分析具有十分重要的意義。

目前，檢測三唑類殺菌劑的方法主要包括液相色譜法（LC）[4]、氣相色譜法（GC）[5]、高效液相色譜法（HPLC）[6]、氣質聯用法（GC-MS）[7]、分光光度法[8]、液質聯用法（LC-MS）[9]、超高效液相色譜-串聯質譜（UHPLC-MS/MS）[10]等。農產品成分越復雜，對低含量三唑類殺菌劑的檢測要求越高，故需探索出一種干擾小、富集能力強的前處理技術，以排除樣品中基質的影響，確保檢測的準確性。

分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer,MIPs）是一種具有與目標分子完全匹配印跡空腔的功能材料[11]。因MIPs 對模板分子具有“記憶”功能，能對其進行特異性識別，并且制備簡單，物理化學性質穩定，目前已被廣泛應用于固相萃取[12-14]、色譜固定相[15]、藥物釋放[16]、傳感器[17-18]和催化劑[19]等領域。

分子印跡固相萃取（molecularly imprinted solid phase extraction，MISPE）作為一種高選擇性前處理技術，在針對其研究與應用上，當前大多局限于單模板印跡體系的研究，不能實現多種物質的同時高效分離與富集。趙春娟等[20]將以三唑醇、烯唑醇和腈菌唑為模板制備的MIPs 按質量比為1∶1∶1混合作為固相萃取柱的填充物用于樣品的前處理，雖取得了較好的效果，但該方式也僅僅是物理復合，并未實現真正的化學復合，而且聚合物顆粒不均勻也會導致吸附不均勻。

本文在本文作者課題組前期研究工作的基礎上，以戊唑醇和三唑酮為雙模板分子，MAA 為功能單體，通過沉淀聚合法制備雙模板分子印跡聚合物，并將其應用于煙葉中三唑類農藥的殘留分析，建立煙葉中戊唑醇、三唑酮及其結構類似物農藥殘留的MISPE-UHPLC-MS/MS檢測方法。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

戊唑醇（tebuconazole, TBZ, 98%）、三唑酮（triadimefon,TDF,98%）、三唑醇（triadimenol,TDM,98%）、莠去津（atrazine, ARZ, 98%） 和西草凈（simetryn, SMT, 98%），德國Dr.Ehrenstorfer 公司；腈菌唑（myclobutanol, MYC, 98.5%），上海阿拉丁公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA，分析純），北京百靈威科技有限公司；偶氮二異丁腈[2,2'-azobis(2-methylpropionitrile)，AIBN，分析純]，天津光復精細化工研究所；其他試劑如甲基丙烯酸（methacrylic acid,MAA）、乙腈和冰乙酸等皆為分析純，天津致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

場發射掃描電子顯微鏡（SEM），Tecnai G2 TF30 STwin 型，荷蘭FEI 公司；傅里葉紅外光譜儀（FTIR），Equinox55 型，德國BRUKER公司；臺式高速離心機，TG16-WS 型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；旋轉蒸發儀，RE-2000A型，上海亞榮生化儀器廠；氣浴恒溫振蕩器，ZD-85型，金壇市城東新瑞儀器廠；超高效液相色譜儀，Agilent 1290 InfinityUHPLC 型，美國Agilent Technologies；質譜儀，AB Sciex Qtrap(TM)3200 MS/MS 型，美國ABSciex，CA。

1.3 分子印跡聚合物的制備

1.3.1 功能單體的篩選

篩選步驟：①采用Gaussian view 5.0分別構建了模板分子和4種功能單體（AA、AM、MAA、TFMAA）的分子模型，運用Gaussian 09 軟件中B3LYP 基組的6-31G+(d,p)水平對模板分子和4 種功能單體的結構進行優化與計算，得出各分子優化構象；②研究模板分子與各功能單體可能形成的復合物情況，并從氫鍵鍵長、氫鍵數目及氫鍵作用的活性位點分析比較模板分子與各功能單體的作用原理及作用力；③按式(1)計算模板-單體復合物的結合能。

式中，ΔEinteraction為模板分子與功能單體的結合能，kJ/mol；Ecorrected為消除了因單體基組重疊造成的能量降低后的A-B 復合物能量，kJ/mol；EBSSE為矯正能，kJ/mol；EA,bAB為A、B基組下A的能量，kJ/mol；EB,bAB為A、B基組下B的能量，kJ/mol。

1.3.2 沉淀聚合法制備雙模板MIPs

于100mL 玻璃瓶中依次加入0.1mmol TBZ、0.1mmol TDF、0.8mmol MAA和50mL乙腈，超聲溶解后通N2除氧，隨后置于氣浴恒溫振蕩器中預聚合12h；在預聚合結束后的溶液中依次加入4mmol EGDMA 和30mg AIBN，混合均勻后通N2除氧15min，然后置于60℃的氣浴恒溫振蕩器中熱聚合24h；熱聚合結束后，將樣品冷卻至室溫，再以10000r/min分離聚合物，倒掉上清液，將所得聚合物干燥至恒重后放入索氏提取器中，用甲醇-乙酸（體積比9∶1）循環洗脫聚合物，直至洗脫液中無TBZ 和TDF 為止，再用甲醇將聚合物洗滌至中性；最后將聚合物干燥至恒重，即得到TBZ-TDFMIPs。作為對照，非分子印跡聚合物（NIPs）的制備除了不加TBZ 和TDF 以外，其他步驟均與TBZTDF-MIPs的制備一致[21-22]。

1.4 MIPs吸附性能探究

1.4.1 動態吸附實驗

稱取若干份MIPs 和NIPs 各10mg 于10mL 離心管中，分別加入20mg/L的TBZ或TDF乙腈標準溶液5mL，混勻后置于室溫下分別吸附10min、30min、50min、70min、90min、110min、130min、150min和170min后過濾膜，收集濾液并用UHPLC-MS/MS檢測濾液中TBZ 或TDF 的濃度，按式(2)計算不同時間下聚合物對TBZ或TDF的吸附量（Q）。

式中，Q為MIPs 或NIPs 對TBZ 或TDF 分子的吸附容量，mg/g；C0和C分別為TBZ 或TDF-乙腈溶液的初始濃度和吸附結束后的濃度，mg/L；V為溶液的體積，L；M為MIPs或NIPs的質量，mg。

1.4.2 靜態吸附實驗

稱取若干份MIPs 和NIPs 各10mg 于10mL 離心管中，分別加入5mL 不同濃度的TBZ 或TDF 乙腈標準溶液（1～80mg/L），室溫下吸附24h后過濾膜，收集濾液并用UHPLC-MS/MS 檢測濾液中TBZ 或TDF的濃度，通過式(2)計算聚合物對TBZ或TDF的吸附容量。

1.4.3 選擇性吸附實驗

稱取若干份MIPs 和NIPs 各10mg 于10mL 離心管中，分別加入20mg/L 的不同農藥（TBZ、MYC、TDM、TDF、SMT 和ARZ）的乙腈標準溶液5mL，混勻后置于室溫下吸附24h后過濾膜，收集濾液并用UHPLC-MS/MS 檢測濾液中TBZ、MYC、TDM、TDF、SMT和ARZ的濃度，通過式(2)計算聚合物對上述6種農藥的吸附容量，探究聚合物的選擇性吸附性能。

1.5 分子印跡固相萃取柱的裝填及應用

1.5.1 加標煙葉樣品的制備

準確稱取3g 干燥后的煙葉樣品分別置于20mL離心管中，添加3mL 3種濃度（0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L）的農殘混標溶液，再加入10mL 乙腈溶液，振蕩混勻后超聲提取1h，經離心、過濾和旋蒸后用3mL乙腈復溶，即得加標煙葉提取液。

1.5.2 分子印跡固相萃取吸附實驗

分別取100mg TBZ-MIPs 和TBZ-TDF-MIPs 制備分子印跡固相萃取（MISPE）小柱，依次加入5mL水和5mL甲醇對萃取柱進行活化后，取2mL的加標煙葉提取液進行上樣，待小柱充分吸附農藥后用5mL 水對萃取柱進行淋洗，再用10mL 甲醇-乙酸溶液（體積比9∶1）對農殘進行洗脫，收集洗脫液并旋蒸除去洗脫劑，再用1mL 乙腈復溶后過濾膜，供UHPLC-MS/MS分析。

1.6 UHPLC-MS/MS分析條件

色譜條件：ACQUITY UHPLC BEH-C18色譜柱（10㎝×2.1mm，1.8μm），流速0.4mL/min，檢測波長228nm，流動相A（0.1%甲酸-水溶液），流動相B（0.1%甲酸-乙腈溶液）。

質譜條件：離子噴射電壓5500V，霧化溫度550℃，掃描方式為正離子掃描，檢測方法為多反應檢測模式。

2 結果與討論

2.1 功能單體的種類及其與模板結合比例選擇

2.1.1 模板分子與功能單體結合位點分析

優化后的模板分子與功能單體的幾何構型及其靜電勢分布如圖1所示，根據顏色標尺可知，顏色越藍的部位表示該位點電正性越強，易失去電子；顏色越紅的部位表示該位點電負性越強，易得到電子。理論上電正和電負性越強的位點即為形成氫鍵的潛在位點[23]，模板與單體的潛在位點情況如表1所示。

表1 TBZ與4種功能單體的潛在結合位點與可能結合氫鍵數

圖1 模板TBZ與單體AA、AM、MAA和TFMAA的靜電勢分布

2.1.2 模板-單體復合物構型及其配比優化

根據靜電勢分布圖將TBZ與各功能單體之間以氫鍵形式相連，并在B3LYP 基組的6-31G+(d,p)下對模板-單體復合物的空間構型進行優化，篩除不符合條件的連接方式并再次優化，最終復合物構型及氫鍵鍵長如圖2所示。

圖2 TBZ與4種功能單體形成復合物的幾何結構

基于上述復合物構型及模板-單體配比優化，對復合物構型進行能量計算，并進行平衡校正，結果如表2所示。由表2可知，TBZ與MAA結合能最大，其次分別是AA、AM 和TFMAA，結合能ΔE越大，表明功能單體與模板分子之間的相互作用力就越強，所得聚合物印跡空腔的活性位點能量就越高，親和性和選擇性也就越強。因此MAA是制備TBZMIPs 的最佳功能單體，且TBZ 與MAA 結合比例為1∶3。針對三唑酮（TDF），其功能單體的篩選過程與TBZ一致，根據本文作者課題組之前的研究結果，MAA 與TDF 之間的結合能最大，且TDF 與MAA 結合比例也為1∶3[21]。為使模板分子與功能單體之間的預組裝更加充分，實際制備時常適當增加功能單體的比例，因此，制備復合模板分子印跡聚合物的摩爾比選為TBZ∶TDF∶MAA=1∶1∶8。

表2 TBZ與4種功能單體相互作用的作用能（ΔE）和氫鍵數

2.2 聚合物的物理表征

2.2.1 微觀形貌表征

采用掃描電子顯微鏡（SEM）對MIPs 和NIPs的微觀形貌進行表征。如圖3 所示，MIPs 和NIPs均為納米級的球形聚合物，并且微球粒徑均一，球形度高，彼此之間無粘連現象。另外MIPs 微球表面粗糙，存在很多孔穴，這些微孔結構有利于MIPs對TBZ和TDF的吸附，而NIPs微球表面則比較光滑。

圖3 聚合物的場發射掃描電鏡圖

2.2.2 紅外光譜表征

為考察雙模板分子印跡聚合物是否制備成功，對兩種模板分子、MIPs 洗脫前后和NIPs 的紅外光譜進行分析，如圖4所示。由圖可以看出，在MIPs洗脫前后以及NIPs 洗脫后的紅外譜圖中，在1732cm-1附近的吸收峰為交聯劑EGDMA中C==O振動峰，1635cm-1附近的吸收峰為EGDMA中C==C振動峰，MIPs 洗脫前后以及NIPs 洗脫后均在1157cm-1處出現尖銳的峰，該峰為EGDMA中O—C—O振動峰，1257cm-1處出現尖銳的峰，該峰為功能單體MAA中C—O振動峰，這些特征吸收峰表明聚合物制備成功。另外TBZ、TDF 和MIPs 洗脫前均在672cm-1處出現吸收峰，這是TBZ和TDF中的C—Cl吸收峰，而該峰未在MIPs和NIPs洗脫后的譜圖中出現，并且MIPs洗脫后和NIPs的譜圖中主要峰形基本一致，表明模板分子TBZ和TDF已經被完全洗脫。

圖4 聚合物洗脫前后和TBZ、TDF的紅外光譜圖

2.3 聚合物吸附性能

2.3.1 動態吸附性能

測試了MIPs和NIPs對TBZ及TDF的吸附量（Q）隨時間的變化關系，如圖5所示。由圖5可知，MIPs對TBZ和TDF的吸附量均隨時間的延長而增加，在150min 時接近吸附平衡，表明MIPs 對TBZ 和TDF具有較快的吸附動力學。盡管NIPs 對TBZ 和TDF的吸附量隨時間的增加而緩慢增加，但是吸附量始終低于MIPs，這是因為MIPs 表面及內部具有與模板分子大小及結構互補的三維印跡空腔，故MIPs對模板分子的吸附是化學吸附和物理吸附并存的，而NIPs對模板分子的吸附僅為物理吸附。

圖5 MIPs與NIPs的動態吸附曲線

2.3.2 靜態吸附性能及Scatchard模型分析

通過靜態吸附實驗考察聚合物對模板分子的吸附性能，繪制MIPs 和NIPs 對TBZ 及TDF 的靜態吸附曲線，如圖6所示。由圖中曲線走勢可知，MIPs對TBZ 或TDF 的吸附量始終高于NIPs，這是因為MIPs 微球中含有與TBZ 或TDF 分子互補的三維印跡空腔，對TBZ或TDF具有記憶功能，能對其進行特異性吸附，而NIPs 無與之互補的印跡空腔，僅通過物理作用吸附TBZ及TDF分子。

圖6 MIPs與NIPs的靜態吸附曲線

采用Scatchard 模型分析MIPs 對模板分子的吸附位點種類、解離常數以及最大吸附量[24]。Scatchard模型如式(3)所示。

式中，Qmax為結合位點的最大表觀結合量，mg/g；Q為MIPs對模板分子的吸附量，mg/g；C為吸附液中模板分子的平衡濃度，mg/L；K為結合位點的平衡解離常數，mg/L。

由圖7 可知，Q/C對Q是非線性關系，MIPs 對TBZ 及TDF 的Scatchard 曲線分成了兩部分，表明MIPs對TBZ或TDF分子的吸附是不均勻的，存在兩類吸附位點。原因可能是在熱聚合過程中，TBZ或TDF分子與功能單體MAA產生了不同的作用方式，同時自由基聚合過程的不穩定性也導致MIPs 表面及內部的印跡空腔大小和數量有所差異，而且除了模板分子的印跡作用，還存在其他共存物的非印跡作用。為研究兩類吸附位點的結合效能，對兩個線性部分進行擬合，分別計算出戊唑醇與三唑酮的平衡解離常數K和飽和吸附量Qmax，結果如表3所示。

圖7 MIPs的Scatchard模型分析

表3 MIPs靜態吸附曲線的Scatchard分析及親和位點分布

2.3.3 選擇性吸附性能

為考察MIPs 的特異性吸附能力，選擇含TBZ、MYC、TDM 和TDF 4 種三唑類殺菌劑，以及SMT和ARZ 兩種三嗪類除草劑的標準液作為吸附液，通過平衡吸附實驗測定MIPs對6種農藥的吸附量，結果如圖8所示。

圖8 MIPs對6種農藥的選擇性吸附性能

由圖8可知，MIPs對6種農藥均有一定的吸附能力，且吸附能力由大到小依次為：TBZ、TDF、MYC、TDM、ARZ和SMT。其中MIPs對TBZ和TDF的吸附效果最好，吸附量分別達到了3.48mg/g 和3.32mg/g，對MYC和TDM的吸附容量也較高，吸附量分別為2.36mg/g和2.32mg/g，而對ARZ和SMT的吸附效果最差，吸附容量僅為1.44mg/g和1.08mg/g。這是因為MIPs 內部存在與TBZ 和TDF 相匹配的印跡空腔，表現出對TBZ 和TDF 特異性吸附，而MYC 和TDM 分子結構與模板分子結構類似，但SMT 和ART 的分子結構與模板分子結構差異大，故MIPs表現出良好的組選擇性以及特異選擇性。

2.4 戊唑醇-三唑酮-MISPE-UHPLC-MS/MS 檢測煙葉中農藥殘留

2.4.1 標準曲線的繪制

分別以6 種農藥（TBZ、TDF、TDM、MYC、ARZ和SMT）的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，擬合標準曲線，結果如表4所示。由表可知，在0.0005～0.1mg/L 濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數R2為0.9991～1.0000。

表4 6種農藥的標準曲線及相關系數

2.4.2 戊唑醇-三唑酮-MISPE對樣品的凈化能力

為評價戊唑醇-三唑酮-MISPE柱對煙葉樣品中農藥的凈化能力，以C18-SPE柱和HLB-SPE柱作為對比，將加標煙葉用3種固相萃取柱進行前處理，然后用UHPLC-MS/MS檢測，對應色譜圖如圖9所示。

圖9 戊唑醇-三唑酮-MISPE對樣品的凈化能力

由圖9 可知，TBZ-TDF-MISPE 柱、C18-SPE 柱和HLB-SPE柱對煙葉樣品均有一定的凈化能力，6種農藥的峰都能很好地分離開來，但3種固相萃取柱的凈化能力差異較大。其中TBZ-TDF-MISPE 柱凈化效果最好，C18-SPE柱和HLB-SPE柱凈化效果次之，因為TBZ-TDF-MISPE 柱能特異性吸附目標分子，而C18-SPE柱和HLB-SPE柱因其無選擇性，通過物理作用同時吸附目標分子和其他雜質。

2.4.3 回收率與精密度

為考察TBZ-TDF-MISPE-UHPLC-MS/MS方法的準確性和重復性，分別在0.2μg/g、0.5μg/g和1μg/g加標水平下進行回收率實驗，結果如表5所示。

由表5可知，樣品中TBZ、TDF、TDM和MYC的回收率在72%～110.3%，相對標準偏差（RSD）為2.38%～7.92%（n=3），而ARZ和SMT的回收率僅為4.35%～15.8%，說明該法選擇性強，回收率高，精密度好，能滿足煙葉中TBZ、TDF、MYC 和TDM的檢測要求。

表5 固相萃取的加標回收率和精密度（n=3）

2.4.4 單模板和雙模板MISPE柱分離效果對比

TBZ-MISPE柱、TDF-MISPE柱[21]和TBZ-TDFMISPE 柱對戊唑醇和三唑酮的回收率如表6 所示。由表6 可知，TBZ-MISPE 柱在加標水平（0.2μg/g、0.5μg/g 和1μg/g）下對TBZ 和TDF 兩者的平均回收率差異明顯，對TBZ達到了110.16%，而對TDF僅為45.3%；TDF-MISPE 柱在加標水平（0.01μg/g、0.05μg/g、0.1μg/g和0.5μg/g）下對TBZ和TDF的平均回收率分別為90.02%和98.27%，二者差異較小；TBZ-TDF-MISPE 柱對TBZ 和TDF 的平均回收率分別為103.32%、99.42%，二者接近。通過對比3種MISPE柱對戊唑醇和三唑酮的分離效果，可以得出雙模板MISPE柱的分離效果優于單模板MISPE柱，雙模板MISPE 柱更有利于實現同時且高效地對樣品中農殘（TBZ和TDF）的分離與富集。

表6 單模板和雙模板MISPE柱分離效果對比

3 結論

以戊唑醇和三唑酮作為雙模板，通過沉淀聚合法制備了具有良好吸附性能的雙模板MIPs。動態吸附結果顯示MIPs 的吸附容量在2.5h 時即可接近飽和；靜態吸附及Scatchard 分析結果表明，MIPs對模板分子具有較強的吸附能力，并且MIPs 的吸附位點不均一，存在高低兩類親和位點；選擇性吸附結果表明MIPs 不僅對戊唑醇和三唑酮具有很好的吸附能力，也對其結構類似物腈菌唑和三唑醇具有一定的吸附能力，而對莠去津和西草凈吸附能力很弱，表現出良好的特異選擇性和組選擇性。以雙模板MIPs 作為固相萃取柱填料制備MISPE 柱，建立了戊唑醇-三唑酮-MISPE-UHPLC-MS/MS 檢測煙葉中4種殺菌劑的方法，并與單模板MISPE柱進行對比。結果表明，戊唑醇-三唑酮-MISPE 柱對三唑類殺菌劑的富集能力優于單模板MISPE 柱，在加標水平（0.2μg/g、0.5μg/g、1μg/g）下的平均回收率為72%～110.3%，RSD 為2.38%～7.92%，滿足煙葉中三唑類殺菌劑殘留分析的要求。另外，基于該MIPs良好的吸附性能，所建立的MISPE-UHPLCMS/MS方法也可以應用于食品、環境中相應三唑類殺菌劑殘留的檢測。