融合多種技術的隱色孔雀石綠印跡傳感器的制備及其應用

秦麗，李東東，田景升，韓俊華，張寅，李建文，高文惠

（1 河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050000；2 石家莊市食品藥品檢驗中心，河北 石家莊 050011）

孔雀石綠（malachite green，MG）屬于人工合成的三苯甲烷類有機化合物，針對魚體水霉病和魚卵的水霉病有特效[1]。然而MG 及其代謝物的高殘留現象和“三致”等毒副作用也已被公開報道[2-3]。我國農業部第235號公告明確規定孔雀石綠禁用于所有食品動物中，所有可食組織中不得檢出。但因為市場上暫時缺少針對水霉病治療的特效藥，許多不法商家為了保證利益不惜鋌而走險，使得MG的違規使用屢禁不止。MG經魚體等迅速代謝后，以毒性更強的隱色孔雀石綠（leuco malachite green，LMG）貯藏在肌肉組織中，食用后可對人類的生命健康造成嚴重傷害[4]。因此，為了加大食品安全監測力度，保障消費者飲食安全，研發高效快速、靈敏且抗干擾能力強的檢測LMG 的方法是一項迫切任務。

國內外用于MG及LMG的檢測方法主要有高效液相色譜法[5-7]、液相色譜-串聯質譜法[8-10]和免疫法等[11-13]。其中色譜法存在儀器昂貴、前處理復雜耗時長、難以實現快速檢測等不足；免疫法存在不耐酸堿、易失活、結果可能出現假陽性等缺點。鑒于水產品樣品中基質復雜，含有較多的干擾物質，需要選擇性更強、穩定性更好的快速檢測方法，而性能優越的分子印跡電化學傳感器（molecularly imprinted electrochemical sensor，MIECS）可滿足要求。

近年來，分子印跡技術與電化學分析技術相結合，彌補了色譜技術的不足，不僅樣品前處理得到簡化，檢測時間短，操作簡單，而且可以特異識別目標物質，靈敏度高，它的應用降低了食品復雜基質對檢測結果的影響[14]；自組裝技術（selfassembled technology，SAT）的引入為增加分子印跡膜（molecularly imprinted membrane，MIM）上有效識別位點帶來了新的思路，模板分子與功能單體間的自組裝賦予了印跡膜一定的有序性，增加了有效印跡位點的數量[15]；紫外光譜法與計算機模擬技術的應用極大地簡化了篩選功能單體的工作，其中，通過計算機模擬技術優化分子構型及其預組裝體系，使得模板分子與功能單體之間的作用形式與作用機理能更清晰、更直觀地呈現[16]；結合紫外光譜法測定其吸光度及最大吸收波長，進一步確定功能單體以及模板分子與功能單體之間的作用形式及比例[17]。因此，SAT、計算機模擬技術和紫外光譜法的引入可為分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）的制備和應用提供理論指導，將MIP對目標物質特異性識別的特點與電化學分析快速檢測的優勢相結合可研制出LMGMIECS，以實現對水產品中LMG 的高效快速檢測，有效監控水產品的質量安全。

目前，融合上述多種技術檢測水產品中LMG的方法尚未見報道。本實驗以LMG 為模板分子，擬以帶巰基及活性基團的苯環結構化合物為功能單體，采用計算機模擬技術、電化學和紫外光譜技術對模板分子和功能單體的預組裝體系進行分析并優化制備條件。采用還原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，RGO） 和 納 米 金 粒 子（Au-nanoparticles，AuNPs）層層修飾玻碳電極，使用SAT 使模板分子與功能單體形成有序自組裝膜，通過電聚合法制備LMG 分子印跡電化學傳感器。通過循環伏安法（cyclic voltammetry，CV）和方波伏安法（square wave voltammetry，SWV）考察該傳感器的電化學性能，并將其應用于實際樣品的快速檢測中。

1 實驗材料和方法

1.1 材料與試劑

CHI660E 型電化學工作站，三電極系統[玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE），Ag/AgCl 參比電極，鉑絲電極]，上海辰華儀器有限公司；S-4800-1 掃描電鏡，日本HITACHI；ALPHAⅡ紅外光譜儀，德國布魯克公司。

LMG （98%），MG （98%） 4-氨基苯硫酚（4-aminothiophenol， 4-ATP， 99%）， 結 晶 紫（98%），氯霉素（98%），喹乙醇（98%），4-羥基苯硫酚（4-mercaptophenol，4-MAP），硫代雙苯硫酚（4, 4'-thiobisbenzenethiol， TBBT）， 殼 聚 糖（chitosan，CS，脫乙酰度≥95%），RGO（98%），阿拉丁試劑有限公司；氯金酸（含金量47.3%），南京試劑廠；其余試劑均為分析純；實驗用水為超純水。實驗樣品：草魚、小龍蝦、海帶（均購于市場）。

1.2 計算機模擬分析

1.2.1 計算平臺

計算軟件：Gaussian 09，Gauss View 6.0。

計算硬件：PC計算機，12GB運行內存，2T硬盤，Windows操作系統。

1.2.2 計算方法

（1）應用Gauss View 軟件建立模板分子LMG與功能單體4-ATP的幾何構型。

（2）利用Gaussian 09 軟件，采用密度泛函理論（density functional theory，DFT）M06-2X[18-19]方法，在6-311+G(d,p)基組條件下，優化LMG 與4-ATP的分子構型，并進行頻率分析，獲取熱力學數據；對各種分子進行紅外光譜分析，以證實分子構型無虛頻且穩定。

（3）采用M06-2X/6-311+G(d,p)算法并加入色散校正項對LMG 與4-ATP 不同比例的復合物模型進行優化并計算其振動頻率，獲取熱力學數據。通過計算所有復合物的結合能大小，分析作用機理。計算結合能時， 基組迭加誤差（basis set superposition error，BSSE）采用目前使用最廣泛的Boys和Bernardi提出的counterpoise方法[20]消除。

結合能ΔE的計算如式(1)所示，校正后能量CΔE計算如式(2)。

式中，Ecomplex為復合物能量；Etemplate為模板分子能量；ΣEmonomer為功能單體總能量；EBSSE為BSSE 校正能。

1.3 AuNPs/RGO/GCE制備

取0.02g RGO 加入10mL DMF，經攪拌、超聲分散后得2g/L RGO-DMF分散液，并將其與相同體積的CS-1% CH3COOH 溶液混合，得到RGO 修飾劑。將其滴涂于GCE表面，烘干后得修飾電極RGO/GCE。將RGO/GCE置于含有0.6g/L HAuCl4·4H2O的0.1mol/L H2SO4沉積液中，采用計時電流法在-0.2V下沉積600s，使RGO/GCE 表面通過電沉積的方式將AuNPs 修飾在RGO/GCE 表面制成金基底，得到沉積電極AuNPs/RGO/GCE。

1.4 MIP/AuNPs/RGO/GCE制備

1.4.1 功能單體的自組裝

將AuNPs/RGO/GCE 浸于10mmol/L 4-ATP 乙腈溶液中，室溫下自組裝20h，使功能單體4-ATP與金基底之間充分形成金硫鍵，讓4-ATP 盡可能多地占據金基底表面；然后將電極移至5mmol/L LMG乙腈溶液中浸泡5h，使得電極表面的4-ATP 與LMG之間充分產生π-π作用。

1.4.2分子印跡電極的制備

將已自組裝的電極置于聚合液中，采用CV 在0～2.2V 電位范圍內進行電聚合，得到一層致密且絕緣的聚合物膜，將已聚合完成的電極浸入乙醇-0.4mol/L NaOH 水溶液（3∶1，體積比）中洗脫50min，用水反復沖洗，得到MIP/AuNPs/RGO/GCE。

1.5 樣品處理

稱取搗碎后樣品（草魚、小龍蝦、海帶）2.00g 置于50mL 離心管中，加入10mL 乙腈溶液，振蕩、超聲、離心（6000r/min、10min）；取上清液，再次加入5mL 乙腈二次提取；合并兩次上清液，用乙腈定容至20mL，待測。

1.6 電化學測量方法

電化學測量的設定參數如下：CV，掃描電位為-0.2～0.8V，掃描速率為50mV/s；SWV，起止電位為-0.1～0.6V，電位增量0.005V，脈沖幅度0.025V，頻率5Hz。

2 結果與討論

2.1 AuNPs/RGO/GCE的形貌表征

采用掃描電鏡對AuNPs/RGO/GCE 的形貌進行表征[圖1(a)]，由圖1(a)可見大量粒徑為60～80nm的AuNPs 顆粒較均勻分布在RGO 表面，這種結構能顯著增大電極的比表面積。此外，通過X射線能量色散譜分析方法[圖1(b)]進一步證明了Au元素在GCE 上的存在，由此表明已成功制備AuNPs/RGO/GCE。

圖1 AuNPs/RGO/GCE的掃描電鏡圖(a)和能譜圖(b)

2.2 紅外光譜表征

利用紅外光譜對LMG、洗脫LMG 前MIP、非印跡聚合物（non-imprintedpolymer，NIP）及洗脫LMG后的MIP的化學結構進行表征（圖2）。圖2(b)中，1515cm-1、1610cm-1為模板分子LMG 中芳環雙鍵伸縮振動吸收峰，1349cm-1為LMG 中芳叔胺的伸縮振動，2883cm-1為LMG 中—CH3的伸縮振動；圖2(b)為LMG 洗脫前的MIP，圖2(a)、(b)的對比證明了洗脫LMG 前MIP 中LMG 的存在；圖2(c)、(d)中，可看出LMG的芳環、氨基、—CH3的吸收峰明顯減弱，洗脫LMG后的MIP與NIP的吸收特征峰曲線幾乎一致，說明在自組裝和電聚合過程中結合在MIP的LMG被大部分洗脫下來，在MIP中留下了與LMG 形狀、大小完全匹配的空穴，可實現對模板分子LMG的特異性吸附。

圖2 紅外光譜圖

2.3 LMG-MIECS電化學性能

采用CV表征修飾電極的修飾效果及LMG印跡傳感器的印跡效果。由圖3(a)中曲線g 可以看出探針離子在裸電極表面上發生了氧化還原反應，形成了對稱且可逆的氧化還原峰；當電極經RGO 修飾后[圖3(a)曲線f]，其峰電流值明顯高于裸電極，這是由于RGO 有效地提高了電子的轉移速率；在RGO 表面沉積一層納米金后峰電流進一步增加，同時在0.2V附近出現了金的特征還原峰，如圖3(a)中曲線e所示，說明AuNPs的修飾明顯提高了電極的靈敏度。當修飾電極完成自組裝后，氧化峰電流明顯下降[圖3(a)曲線c]。修飾電極經電聚合后[圖3(a)曲線b]響應電流值幾乎為0，表明此時電極表面形成了致密且幾乎不導電的MIM。經洗脫模板分子后的印跡電極[圖3(a)曲線a]由于洗脫劑破壞了功能單體與模板分子之間的作用力，使模板分子脫附下來，形成與模板分子空間結構相吻合的三維印跡空穴，探針離子通過印跡空穴在電極表面實現電子轉移。此外，實驗進一步采取SWV 對結果進行了驗證，通過比較圖3(a)、(b)可以看出兩種表征方法效果一致。結果表明LMG 印跡傳感器已被成功制備并具有良好的修飾效果和印跡效果。

圖3 MIECS修飾效果和印跡效果表征

2.4 功能單體的選擇及計算機模擬預組裝體系分析

2.4.1 功能單體的設計

依據自組裝技術，通過對工作電極外層修飾材料性質以及LMG 的結構及其所含官能團[圖4(a)]進行分析，選取最佳功能單體，設計LMG-MIECS。與功能單體相連的外層修飾材料是經AuNPs 修飾后的金粒子基底，因此功能單體的首端基團可使用巰基等可與金基底形成穩定Au—S鍵的官能團。功能單體與修飾層間形成穩固的共價鍵，能提高印跡位點與MIM 的穩定性。LMG 分子結構中帶有三個苯環，其環結構與π鍵特性較為明顯，因此考慮選用帶有苯環的功能單體，可與LMG 通過苯環之間的π-π 作用相結合，并且苯環的堆疊增大了分子間的摩擦力，有利于增加功能單體間的緊密程度，減少MIM 結構松散等問題。經考察，4-ATP、4-MAP、TBBT 基本滿足設計要求，其結構式如圖4(b)～(d)所示。

圖4 模板分子與功能單體結構式

2.4.2 紫外光譜法篩選功能單體

選擇合適的功能單體在MIECS 的制備過程中起著非常重要的作用，然而大多數模板分子結構較為復雜，酸性、堿性等多種性質差異較大的基團往往共存于同一分子結構中，同時由于空間位阻對分子間穩定結合的阻礙，導致難以單純依靠經驗篩選出最佳功能單體以及對模板分子與功能單體的配比進行判斷。電化學法作為傳統篩選功能單體的方法，工作量較大且耗時較長。然而，紫外光譜法可以克服上述缺點，能簡單準確地篩選功能單體及其與模板分子的配比[21-22]。在紫外光譜理論中，當兩種物質不發生作用時，該兩種物質混合物的吸光度在任意波長下應為兩者吸光度數值的加和，此數值被稱為吸光度的理論值[23]。然而分子之間受共軛效應、氫鍵等相互作用的影響，會使混合物吸光度的大小偏離理論值，即實際測量值與理論值之間會產生一定差異。當吸光度的理論值與實際值之間差值越大，表明兩者之間的相互作用力越強[17]。

實驗初步對4-ATP、TBBT、4-MAP 三種常見功能單體進行篩選，如圖5所示。在最大吸收波長下，三種功能單體和LMG 作用的實際吸光值與理論吸光值之差分別為0.6580、0.4258 及0.4781，由此可知LMG 與4-ATP 之間的相互作用力最大。因此確定最佳功能單體為4-ATP。

圖5 模板分子與功能單體紫外光譜曲線

2.4.3 分子構型優化及紅外光譜分析

根據ChemFinder 檢索得到模板分子與所選功能單體的結構式，用Gauss View 6.0 軟件分別構造各分子初始模型，使用Gaussian 09 軟件在M06-2X/6-311+G(d,p)水平下優化分子構型，并對振動頻率進行計算，優化后的各分子構型如圖6所示。

圖6 分子構型優化

通過對優化后的分子進行紅外光譜分析，如圖7所示，可明顯看出模板分子與功能單體的振動頻率。LMG 與4-ATP 的最低頻率分別為23.93cm-1和117.19cm-1，在所有模式下的振動頻率均為正值，未出現虛頻現象，說明在該計算方法下所有構型均得到收斂。

圖7 LMG和4-ATP的紅外光譜圖

2.4.4 計算機模擬分析預組裝體系結合能

通過構建LMG 與4-ATP 比例為1∶1、1∶2 及1∶3 的復合物模型，優化不同比例下復合物的構型，優化后的各比例下最優構型如圖8所示。對比不同比例復合物優化后的結果，可見LMG-2(4-ATP)型復合物在空間構型上較為規則、緊密，如圖8(b)所示。2 個4-ATP 分子通過苯環間的共軛效應緊密結合在LMG 分子上，空間上的緊密性確保了所形成的印跡“空穴”在大小和形狀上與LMG互補，更好地顯示其特異性；并且2個4-ATP分子上的巰基均在LMG 分子的同一側，在空間上更方便與AuNPs 成鍵，使得自組裝的有序性更為明顯，與紫外光譜法篩選功能單體的結果一致。當繼續增加功能單體數量時，如圖8(c)所示，所增加的4-ATP在空間上未與LMG上的苯環產生共軛作用。

圖8 不同比例模板分子與功能單體的復合構型優化

LMG與4-ATP不同比例復合物的結合能如表1所示。結果表明，復合物中4-ATP 數量增加時，所釋放的熱量隨之增加。形成LMG-2(4-ATP)型復合物所釋放的熱量與形成LMG-(4-ATP)型復合物所釋放的熱量相比增加了57.459kJ/mol，形成LMG-3(4-ATP)型復合物時釋放出的熱量比上一級僅增長了16.223kJ/mol，遠小于之前的增幅，說明LMG 與4-ATP 形成LMG-2(4-ATP)型復合物時，LMG 上所結合4-ATP 的能力達到飽和，因此主要形成了LMG-2(4-ATP)型復合物且該復合物空間構型穩定。

表1 不同比例模板分子與功能單體復合物的能量和結合能

2.5 實驗條件的優化

2.5.1 自組裝時間的優化

實驗對功能單體與金基底通過自組裝形成金硫鍵至飽和的時間進行了探究，實驗從16h起每隔2h對自組裝電極進行一次CV 表征，如圖9 所示。隨著自組裝時間增加，金的特征還原峰逐漸減弱，當自組裝時間達20h 時，金的特征還原峰基本消失，說明此時功能單體與金基底之間的結合已達飽和狀態，因此選取最佳自組裝時間為20h。

圖9 自組裝時間的優化

2.5.2 聚合體系中模板分子與功能單體物質的量濃度比的確定

在MIM 聚合過程中，功能單體的用量會影響MIECS的靈敏性和穩定性。一方面，如果功能單體數量過少，會延長MIM 的形成時間，阻礙模板分子與功能單體之間的結合，從而會降低印跡位點的數量和MIECS 的靈敏性。另一方面，過多的功能單體會導致功能單體自身產生締合現象，使特異性識別位點減少，降低選擇性[24]。

實驗采用紫外光譜法對聚合體系中模板分子與功能單體的配比進行了優化，如圖10(a)所示。以不同物質的量比混合體系的紫外光譜最大吸收為縱坐標，最大吸收波長為橫坐標作圖，如圖10(b)所示。可知在(1∶1)～(1∶4)的比例范圍內混合體系的紫外吸光度呈上升趨勢，且最大吸收波長發生了明顯藍移，說明在(1∶1)～(1∶4)的物質的量比內，隨著4-ATP 比例的增大，LMG 與4-ATP 之間形成的共軛效應逐漸增強，進一步驗證了計算機模擬對LMG 與4-ATP 之間預組裝體系結合能的理論計算結果。當混合體系物質的量比在(1∶4)～(1∶8)的范圍內又產生了紅移現象，說明繼續增大功能單體的比例會使功能單體之間發生自聚，使得功能單體之間出現締合現象，會減少印跡位點的生成，降低靈敏度。因此確定聚合體系中LMG 與4-ATP 的最佳物質的量比為1∶4。

圖10 紫外光譜法優化聚合體系配比

2.5.3 聚合圈數的優化

實驗采用CV 進行電聚合，該方法形成的MIM表面致密均勻且可通過改變聚合圈數對MIM 的厚度進行控制。由圖11可知，隨著聚合圈數的增加，電極的響應峰電流值不斷減小；當掃描20 圈時，響應值趨近于0；而聚合超過20 圈的MIM 在洗脫模板分子后仍存在不同程度的模板分子被包埋的現象，使形成的印跡空穴相對較少，導致洗脫后的MIM 在表征溶液中的響應峰電流下降。因此，實驗確定最佳聚合圈數為20圈。

圖11 聚合圈數的優化曲線

2.5.4 洗脫條件的優化

對MIM 進行模板分子洗脫時發現，通過在乙醇、甲醇等極性溶液中浸泡的方式洗脫，效果不理想。因此，通過在洗脫劑中加入酸、堿的方式增大洗脫劑極性從而加大洗脫劑對模板分子與功能單體間作用力的破壞程度。但使用酸性洗脫劑洗脫時發現MIM有破裂現象，是因為RGO修飾層中的CS溶于弱酸，使得RGO 修飾層被破壞。因此選擇在甲醇、乙醇、乙腈中添加NaOH 制成堿性洗脫劑對MIM進行洗脫，結果表明，乙醇-0.4mol/L的NaOH水溶液（3∶1，體積比）作為洗脫劑時，具有良好的洗脫效果，而其他條件下洗脫效果均不佳。

實驗進一步優化了洗脫時間，將印跡電極置于洗脫劑中進行攪拌洗脫，每5min 取出電極，用水沖洗，氮氣吹干，采用SWV 進行表征，結果如圖12所示。當洗脫50min時峰電流達到最大，之后逐漸趨于平穩，說明50min 時MIM 上的LMG 最大程度上被去除。綜上確定洗脫時間為50min。

圖12 模板分子洗脫時間優化曲線

2.6 選擇性

選取與模板分子LMG結構類似的MG和結晶紫作為結構類似物，干擾物質選用可能用于治療水產品疾病的藥物氯霉素和喹乙醇，將印跡傳感器分別在1μmol/L的五種藥品的標準溶液中吸附相同的時間，通過SWV 考察吸附前后的響應峰電流變化（ΔI）以研究傳感器的選擇性，結果如圖13 所示。由圖13 可見，該傳感器對LMG 吸附能力最強，對MG 的吸附能力稍低，對結晶紫的吸附能力較小，而對干擾物質幾乎無響應。結果表明該MIECS 具有良好的選擇性。

圖13 印跡電極的選擇性

2.7 線性關系與檢出限

配制濃度為1.0×10-4～1.0×10-11mol/L 的LMG 標準溶液，將印跡電極浸泡到空白溶液及上述不同濃度的LMG 標準溶液中吸附相同時間，分別測定吸附后電極的SWV 響應曲線，以不同濃度LMG 標準溶液對應的-lgC為橫坐標，ΔI為縱坐標作圖。通過圖14 可以看出，LMG 在3.3×10-11～1.0×10-6mol/L濃度范圍內與ΔI呈良好線性關系，線性方程為ΔI=0.8004lgC+15.1457，線性相關系數R2=0.9914，以S/N=3確定LMG的檢出限為1.0×10-11mol/L。

圖14 線性關系曲線

2.8 回收率與精密度

在最佳實驗條件下，按1.5 節方法處理的水產樣品（草魚、小龍蝦、海帶）在1.0×10-9mol/L、1.0×10-8mol/L 和1.0×10-7mol/L 加標水平下進行回收率實驗，結果如表2所示。樣品加標平均回收率為85.5%～101.2%，RSD為1.28%～2.48%（n=5）。結果表明該MIECS的測定結果準確可靠。

表2 水產樣品的加標回收率和精密度（n=5）

2.9 重現性與穩定性

平行制備3支印跡電極，進行連續吸附（同一濃度的LMG標準溶液）-洗脫-檢測20次，并在表征溶液中分別對其進行電化學檢測，相對標準偏差小于等于1.82%（n=20），表明此MIECS 重現性良好。實驗將制備的印跡電極在4℃下保存，分別在放置7d、14d、21d 后，在探針離子溶液中對其進行電化學檢測，其實際測量值分別為初始值的92.6%、89.9%及83.2%。結果表明，制得的LMG印跡電化學傳感器穩定性良好，可在一定條件下穩定保存并重復使用。

2.10 實際樣品檢測

將印跡傳感器應用于小樣本量的實際樣品（草魚、小龍蝦、海帶）的檢測中，按1.5節方法處理樣品，取10mL 樣液，通過1.6 節方法檢測，結果未在樣品中檢出LMG。

2.11 與其他方法比較

與文獻報道的其他方法比較，如表3所示。本實驗方法檢出限低，線性范圍寬，滿足樣品中LMG檢測要求。

表3 本文方法與其他測定LMG的方法比較

3 結論

以RGO 和AuNPs 作為玻碳電極的納米修飾材料，其比表面積大、導電性能高、穩定性好，可提高電極的靈敏度；以LMG 為模板分子，將紫外光譜法與計算機模擬計算相結合篩選4-ATP 為功能單體；通過自組裝20h 與電聚合20 圈制備LMGMIECS。應用計算機模擬技術對模板分子與功能單體之間的作用形式和機理進行研究，兩者通過共軛效應產生相互作用，形成了構型穩定的LMG-2(4-ATP)型復合物；結合紫外光譜法進一步驗證，在1∶1～1∶4 的物質的量比范圍內，LMG 與4-ATP之間的共軛效應隨著4-ATP比例的增大逐漸增強，形成與LMG在大小和形狀上互補的印跡“空穴”。

通過CV、SWV 對制備條件進行優化，并對該MIECS 的印跡效果、選擇性及分析性能進行了考察。結果表明，所制備的MIECS 具有優異的印跡效果以及良好的選擇性、重現性與穩定性；該方法在3.3×10-11～1.0×10-6mol/L 之間線性關系良好，檢出限為1.0×10-11mol/L，樣品平均回收率為85.5%～101.2%，RSD 為1.28%～2.48%。因此，本實驗將計算機模擬技術、紫外光譜技術、自組裝技術及電化學分析等多種技術相融合制備的LMG-MIECS 可用于水產品中LMG 的靈敏快速檢測，滿足食品安全快檢需求。本研究有望為簡化、精準地篩選功能單體以及開發性能更優越的分子印跡電化學傳感器的研究提供新的思路和方法。