HNTs-NaClO2復合材料的制備及抑菌效果

谷娜，趙東亞，高金龍，林翠，任偉杰，王田田，劉欣偉

（1 河北科技大學理學院，河北 石家莊 050018；2 河北科技大學化學與制藥工程學院，河北 石家莊 050018）

細菌是借助人體皮膚黏膜表面的一些特殊成分和結構附著在人體皮膚黏膜表面，然后以不同的方式引起疾病[1]。雖然細菌和其他微生物可以促進自然界物質的代謝循環，但不受控制地生長會損害人類健康，甚至阻礙經濟發展[2]。抗生素因其優異的殺菌能力而成為最被接受的治療方法。然而，隨著多重耐藥菌的進化，傳統抗生素的藥效逐漸下降，可能會產生超級細菌，從而導致更嚴重的后果[3]。開發新的抗生素費時費力，導致新抗生素持續缺失。更糟糕的是，現有抗生素耐藥性的流行率在不斷增加。因此，開發抗細菌感染的新型抗菌材料是最關鍵的問題[4]。隨著科技的不斷發展，新型抗菌劑逐漸走進了人們的視野。目前，抗菌劑已經廣泛應用于化妝品[5]、食品包裝[6]、塑料[7]、醫療衛生[8]、紡織品[9]等各個方面。

抗菌劑載體能通過不同方式對抗菌劑進行負載，可以實現抗菌藥物緩釋，且載體具有較大的孔徑以及比表面積，能夠擴大抗菌劑的負載效率[10-11]。埃洛石納米管（HNTs） 化學式為Al2Si2O5(OH)4·2H2O，呈天然的中空管狀結構，管內徑為10～150nm，管長1～15μm。它的外表面含有和Si—O基團，內表面含有Al-OH基團，分別帶有正負電荷，有利于其與各種不同電性粒子的結合[12]。HNTs 具有獨特的納米管狀結構以及較大的比表面積，無細胞毒性，且具有良好的生物相容性[13]。Barman等[14]采用真空操作和超聲技術將諾氟沙星作為模型藥物負載到HNTs中并觀察其抗菌活性。結果表明，該材料具有柔韌性，可以持續釋放諾氟沙星，且有一定的抗菌性，細胞毒性研究表明HNTs本質上是生物相容的。因此，該復合材料能夠維持藥物輸送，可以用于傷口愈合或其他醫學應用。Lisuzzo等[15]利用殼聚糖和埃洛石納米管之間的靜電相互作用來制備具有向khellin 受控釋放特性的雜化納米結構，研究表明殼聚糖層包裹的埃洛石納米管可以有效地用作藥物輸送系統。亞氯酸鈉（NaClO2）可作為殺菌劑、漂白劑使用，可應用在空氣凈化[16]、食品安全[17]、消毒[18]等領域。由于亞氯酸鈉自身沒有緩釋性，本文利用HNTs 作為抗菌劑載體，制備HNTs-NaClO2抑菌材料，對其釋放以及抑菌性能進行探索，圖1 為制備HNTs-NaClO2復合材料的實驗流程。

圖1 制備HNTs-NaClO2復合材料的實驗流程

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

材料：埃洛石，石家莊騰瑞礦產產品貿易有限公司；亞氯酸鈉，石家莊市科大綠源發展有限公司；硫代硫酸鈉、六偏磷酸鈉，天津市永大化學試劑有限公司；碘化鉀，天津市科密歐化學試劑有限公司；淀粉，天津市永大化學試劑有限公司；重鉻酸鉀，萊陽市康德化工有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，北京生物保藏生物科技有限公司；蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉，天津市英博生化試劑有限公司。

儀器：X 射線衍射儀（XRD），日本Rigaku 公司D/MAX-2500 型；透射電子顯微鏡（TEM），德國電子有限公司JEM-2100 型；傅里葉紅外光譜（FTIR），美國鉑金埃爾默公司FTS-65A1896 型；場發射掃描電子顯微鏡（SEM），日本HITACHI 公司S-4800-I型。

1.2 HNTs的預處理

首先使用去離子水洗滌HNTs，除去HNTs 中不溶性雜質。稱取HNTs 5.0g，加入到25mL的去離子水中，將其混勻，再向混合后的溶液中加入0.125g分散劑六偏磷酸鈉，攪拌2h。將攪拌后的溶液離心，去除沉淀后，再將懸浮液進行離心，用去離子水洗滌3次后，將所得沉淀在60℃下真空干燥24h。將干燥后所得到的固體采用一定濃度的氫氧化鈉溶液進行處理。將HNTs分散到氫氧化鈉溶液中，超聲30min，攪拌10h。將攪拌后的溶液離心，去掉上層堿液，過濾，水洗至中性，將濾餅在80℃真空干燥24h，得到堿處理后的HNTs。

1.3 HNTs-NaClO2的制備

根據行業標準《工業亞氯酸鈉》（HG/T 3250—2010）[19]對亞氯酸鈉溶液的濃度進行檢測。本實驗采用真空抽吸的方式制備HNTs-NaClO2復合材料。

稱取一定質量的HNTs，置于飽和亞氯酸鈉溶液中，邊攪拌邊抽真空，每隔30min關閉攪拌并卸下真空，5min 后繼續抽真空。2h 后將所得溶液過濾得濾餅，40℃置于真空干燥箱內烘干24h，研磨，得樣品備用，濾液用滴定法測定其含量。NaClO2負載量的計算如(1)所示。

式中，m0是溶液中亞氯酸鈉的初始質量，g；mf是濾液中亞氯酸鈉的質量，g；mads是HNTs 的質量，g。

采用單因素考察法探索負載工藝對NaClO2負載量的影響。

（1） 在保持其他條件不變的情況下，設置不同的攪拌時間分別為60min、90min、120min、150min、180min。

（2） 在保持其他條件不變的情況下，設置不同的浸泡時間分別為0min、 10min、 20min、30min、40min。

（3） 在保持其他條件不變的情況下，設置不同負載比例（HNTs∶NaClO2）分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6。

1.4 HNTs-NaClO2的釋放

將HNTs-NaClO2復合材料在中性介質中進行釋放。稱取一定量的HNTs-NaClO2復合材料置于試管中，加入10mL 的去離子水，充分混勻后靜置，在一定時間后，從試管中取一定質量的上清液進行測定，同時在試管中加入等量的去離子水。采用碘量法測定溶液中的亞氯酸鈉含量。根據式(2)計算亞氯酸鈉的累積釋放率。

1.5 HNTs-NaClO2的抑菌

根據《消毒技術規范第一分冊》[20]配制Luria-Bertani（LB）液體培養基、LB 固體培養基和相應的菌懸液。采用抑菌圈法對HNTs-NaClO2進行評價。稱取不同質量的HNTs-NaClO2復合材料，將其溶于滅菌水中，分別配制濃度為1.25g/L、2.50g/L、3.75g/L、5.00g/L、6.25g/L、7.50g/L 的樣品。將滅菌后的LB固體培養基倒入無菌平板中，轉動平板，使培養基在平板中厚薄均勻。靜置，待其冷卻凝固后，將菌懸液均勻涂布在含有培養基的平板上。用移液槍吸取20μL 不同濃度的樣品溶液，滴加到滅菌后的濾紙片的表面，對照濾紙片滴加20μL 濃度為0.9%的生理鹽水作為空白對照實驗，然后將濾紙片平放在平板表面，蓋好平板，置于37℃電熱恒溫培養箱倒置培養16～18h 后，觀察結果，記錄抑菌圈直徑的大小。

1.6 急性經口毒性實驗

根據《消毒技術規范第一分冊》對HNTs-NaClO2進行急性經口毒性實驗。采用霍恩（Horn’s）法對HNTs-NaClO2的半數致死量（median lethal dose, LD50）進行測定。選用18～22g SPF 級昆明種小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，雌雄各半。按2.15g/kgBW(BW 指體重)、4.64g/kgBW、10.00g/kgBW、21.50g/kgBW劑量對小鼠進行灌胃，灌胃容量為20mL/kgBW。另取SPF 級昆明種小鼠10 只，雌雄各半，灌入等量的生理鹽水。給藥后觀察小鼠14 天內的毒性反應和死亡情況，記錄各組動物的一般生理狀況、進食飲水、活動狀態、有無中毒狀態和有無動物死亡，實驗結束后將小鼠用頸椎脫臼致死法處死，進行解剖學檢查。根據霍恩法LD50值計算用表計算小鼠的LD50值，表1為急性毒性分級標準。

表1 急性毒性分級標準

2 結果與討論

2.1 HNTs-NaClO2復合材料的表征

2.1.1 XRD分析

圖2 為原始HNTs、HNTs-NaClO2復合材料和NaClO2的XRD圖譜。從圖中可以看出，HNTs負載亞氯酸鈉后的XRD 圖與原始HNTs 和亞氯酸鈉的XRD圖譜明顯不同，且HNTs負載亞氯酸鈉的特征衍射峰較尖銳，結晶度較好。在12.15°、20.14°、24.94°分別對應原始HNTs 的(001)、(100)、(002)晶面峰，在31.75°、45.55°、54.05°分別對應NaClO2的(200)、(220)、(311)晶面峰。

圖2 原始HNTs、HNTs-NaClO2復合材料和NaClO2的XRD圖

2.1.2 FTIR分析

圖3 為原始HNTs、HNTs-NaClO2復合材料和NaClO2的FTIR 圖譜。與原始HNTs 和NaClO2的紅外光譜圖相比，負載飽和亞氯酸鈉溶液的紅外光譜圖在843cm-1、434cm-1附近出現特征吸收峰，證明在HNTs成功負載亞氯酸鈉晶體。

圖3 原始HNTs、HNTs-NaClO2復合材料和NaClO2的FTIR圖譜

2.1.3 TEM分析

圖4 為原始HNTs 和HNTs-NaClO2復合材料的TEM 圖。由圖中可以看出負載后的HNTs 呈透明狀，管徑為50～100nm，管長為400～800nm，部分管體發生斷裂，與原始HNTs 相比較，負載后的HNTs 表面有部分結晶，證明已經成功負載上亞氯酸鈉。

圖4 原始HNTs和HNTs-NaClO2復合材料的TEM圖

2.1.4 EDS分析

表2 為原始HNTs 和HNTs-NaClO2復合材料元素質量分數，圖5為原始HNTs和HNTs-NaClO2復合材料的EDS 圖。從表2 的數據中可以得出在HNTs上有Na 元素和Cl 元素的存在，且比例接近1∶1，表明HNTs已經負載上亞氯酸鈉。

圖5 原始HNTs和HNTs-NaClO2的EDS圖

表2 原始HNTs和HNTs-NaClO2元素質量分數

2.2 負載工藝對NaClO2負載量的影響

2.3 HNTs-NaClO2復合材料的釋放結果

圖6為負載比例對HNTs-NaClO2復合材料釋放結果的影響。由圖可以看出，在釋放達到第4 天時，釋放趨于平穩，負載比例為1∶4 時，其釋放性能較好，累積釋放量為1.43%。在釋放初期，釋放速率不斷增大，增加到一定值后保持穩定持續釋放，說明HNTs-NaClO2具有一定的緩釋性。

表3 不同負載工藝對NaClO2的負載量的影響

圖6 負載比例對HNTs-NaClO2復合材料的釋放結果的影響

2.4 HNTs-NaClO2復合材料的抑菌結果

圖7為HNTs-NaClO2復合材料負載比例為1∶4時的抑菌結果，表4為濃度對HNTs-NaClO2復合材料的抑菌圈直徑的影響（±SDmm）。結果表明，HNTs-NaClO2復合材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用；隨著樣品濃度的增加，抑菌圈直徑也隨之增加，抑菌作用也隨之增強。

表4 濃度對HNTs-NaClO2復合材料的抑菌圈直徑的影響（±SD） 單位：mm

圖7 濃度對HNTs-NaClO2復合材料抑菌結果的影響

2.5 急性經口毒性實驗結果

表5 各組小鼠實驗結果

度為4.64g/kgBW時，小鼠部分死亡，給藥濃度為2.15g/kgBW時，小鼠均未死亡。根據霍恩法LD50值計算用表，樣品對雌性小鼠的LD50為5.84g/kgBW，可信限為4.30～7.94g/kgBW，樣品對雄性小鼠的LD50為5.01g/kgBW，可信限為3.44～7.30g/kgBW。雌雄小鼠的LD50均大于5.00g/kgBW，根據急性毒性分級標準，屬于低毒級別。解剖后肉眼觀察灌胃后死亡的小鼠內臟的顏色與對照組的內臟顏色明顯不同。

3 結論

（1）通過XRD、FTIR、TEM、EDS 分析證明HNTs 已經成功負載上了亞氯酸鈉，得到HNTs-NaClO2復合材料。通過改變HNTs 在飽和亞氯酸鈉溶液中攪拌時間和負載比例可以提高NaClO2的負載量。

（2）釋放實驗結果表明，HNTs-NaClO2復合材料在第4 天時達到穩定期，穩定期濃度為1.43%。抑菌實驗結果表明，HNTs-NaClO2復合材料對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有抑制作用。此外，急性經口毒性實驗表明，HNTs-NaClO2對雌雄小鼠的LD50均大于5.00g/kgBW。

（3）HNTs-NaClO2復合材料具有一定的緩釋性和抑菌性。HNTs-NaClO2復合材料具有潛在應用價值，仍需完善在應用方面（如紡織品的抗菌整理）的實驗。