ST6-40轉基因棉花株系的獲得與耐鹽性鑒定

朱永紅，吳慎杰，李 靜，張換樣，焦改麗，竹夢婕，秦麗霞

（1.山西農業大學 棉花研究所，山西 運城 044000；2.棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽 455000）

棉花是世界上重要的經濟作物之一，我國人口多耕地少，糧棉爭地的矛盾一直比較突出。提高棉花品種的耐鹽性，發展鹽堿地植棉，拓寬植棉面積對于我國棉花生產以及糧食生產具有重要意義[1]。從“七五”開始，我國開始開展棉花耐鹽堿育種工作，山東農業大學等單位已經育成了山農N0、2F502-2、商丘40一些耐鹽性較好的品種[2]。然而，常規耐鹽育種選育的棉花品種遺傳基礎狹窄，選育周期長，且常規品種耐鹽能力很有限。而且傳統的遺傳育種方法并不能很有效地提高植株耐鹽脅迫應答能力[3-4]。因此，利用基因工程技術培育棉花抗逆（高鹽、干旱、低溫等）新品種已經成為棉花育種領域的新趨勢。

利用基因工程技術研發耐鹽棉花品種，已經進行了大量的研究。例如，嗜鹽孢子菌H+-PPase基因TsVP在高鹽條件下可改善棉花根和莖的生長和光合活性。與野生型相比，轉基因植物的膜離子泄漏和丙二醛水平降低，轉基因植物有助于Na+和Cl?在液泡的隔離。TsVP的表達也提高了棉花的發芽率和存活率，在高鹽環境下改善纖維質量。另一項研究表明，擬南芥液泡焦磷酸酶編碼AVP1的表達改善了轉基因棉花在鹽脅迫下的生長和纖維產量[5]。ST6-40基因是采用功能基因挖掘的方法分離得到的。在鹽脅迫下，基于小鹽芥cDNA文庫的表達，構建源種質cDNA表達文庫，利用農桿菌介導法轉化擬南芥，建立了超過125 000個獨立株系組成的轉基因種子文庫，通過高通量遺傳篩選法篩選耐鹽株系，分離出多種耐鹽株系，通過PCR擴增和測序鑒定小鹽芥CDNA，分離得到了ST6-40基因。這種功能基因挖掘方法強調了表達基因的功能，因此克隆的基因與耐鹽功能直接相關。在擬南芥過量表達ST6-40基因，植物根系長度、葉片及株高都有顯著提高[6-7]，但有關其耐鹽機理目前尚不清楚。

本研究擬將ST6-40基因轉入棉花品種R15中，通過對獲得的轉基因株系進行多代的PCR鑒定和耐鹽鑒定，以獲得ST6-40基因能穩定遺傳且耐鹽性強的轉基因棉花品系，旨在為培育抗逆性棉花新種質提供科學參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

R15，為山西農業大學棉花研究所利用陸地棉品種晉棉7號經過多代再生選育出的胚胎發生純合系；陸地棉耐鹽對照品種中99807，由中國農業科學院棉花研究所提供；pCB2004-ST6-40重組載體（圖1），由中國科技大學生命科學學院實驗室構建并提供；利用農桿菌介導法轉化R15受體，并通過PCR檢測[8]獲得ST6-40轉基因陽性棉花株系ST6-40-1～ST6-40-65。

圖1 重組載體pCB2004-ST6-40示意Fig.1 Schematic representation of the recombinant vector pCB2004-ST6-40

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因ST6-40的核苷酸序列和蛋白序列分析利用生物信息學對目的基因ST6-40（NCBI序列號：ACF23021.1）的核苷酸序列和蛋白序列進行分析。

1.2.2 農桿菌介導的棉花遺傳轉化法以R15為受體，以下胚軸為外植體，參考陳志賢等[9]的方法構建轉基因棉花。T0按單株種植，并進行PCR檢測[8]，檢測結 果為陽性 的單株，后 代經T1、T2、T3連續3代按株行種植，先后進行葉片噴草銨膦除草劑抗性鑒定及目的基因PCR檢測，檢測結果全為陽性的植株確定為ST6-40轉基因棉花純合株系。

1.2.3 轉基因棉花的PCR鑒定及純合系篩選在超凈臺上取再生小植株2～3片嫩葉，CTAB法提取R15材料和轉基因棉花的基因組DNA，并稀釋至100 ng/μL。通過PCR和產物測序鑒定其純合性，反應體系為25μL，包 括2.5μL 1×PCR buffer，1.5μL 1.5 mmol/L MgCl2，2.0μL 0.2 mmol/L dNTPs，0.5μL P1（0.2μmol/L）引物（表1），0.5μL P2引物（0.2μmol/L），2.0μL Template DNA，0.5μLTaqDNA聚合酶，15.5μL ddH2O。PCR反應程序為：95℃預變性3 min；循環擴增階段：95℃40 s→58℃30 s→72℃60 s，循環35次；最后72℃延伸保溫7 min。擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.4ST6-40轉基因棉花RNA水平上的鑒定取0.05～0.10 g的幼嫩葉片，分別按照RNA抽提試劑盒（TransZol Plant ET121，Trans）和cDNA一鏈合成試劑盒（Cat#PR037A，TaKaRa）說 明 提 取RNA并反轉錄為cDNA。采用SYBR Green Su‐permix（大連寶生物公司）進行定量PCR反應。反應體系為10μL：包括1.0μL 1×PCR buffer，1.0μL 1.5 mmol/L MgCl2，1.0μL 0.2 mmol/L dNTPs，0.2μL P1（0.2μmol/L）引物（表1），0.2μL P2引物（0.2μmol/L），1.0μL Template DNA，0.2μLTaqDNA聚合酶，5.4μL ddH2O。反應程序：95 °C 20 s；94 °C 3 s，60 °C 30 s，擴增40個循環。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.5 轉基因棉花耐鹽性鑒定T1、T2轉基因陽性植株采用盆栽種植，在花鈴期用300 mmol/L NaCl澆灌脅迫7 d后采用酸性茚三酮法[10]測定葉片游離脯氨酸含量，以判斷棉花耐鹽性差異，游離脯氨酸含量高的品系判定為耐鹽性較好。

1.2.6 T3轉基因棉花耐鹽性鑒定將T3陽性純合株系轉基因棉花及受體對照種子播種于育苗盤中，每個待測材料進行3次重復，每個重復種50株，試驗管理按照轉基因生物安全要求進行。80%苗長至2葉時，將育苗盤放入底部隔水的鹽池，在鹽池底部澆入1.5%的鹽水，鹽水以剛沒過育苗盤為準。施鹽后7 d調查棉苗受害情況，每個待測材料調查3個重復，每個重復隨機調查20株。根據棉花鹽害分級方法和鹽害指數計算方法，計算待測棉花材料的鹽害指數。利用SPSS 22.0統計分析軟件對試驗結果進行方差分析。鹽害分級癥狀描述如下：0級，棉苗無黃葉；1級，有1片子葉發黃；2級，2片子葉均發黃；3級，有1片子葉受害脫落；4級，有2片子葉受害脫落。

2 結果與分析

2.1 目的基因ST6-40生物信息學相關分析

目的基因ST6-40（（NCBI序列號：ACF23021.1）cDNA全長為510 bp，編 碼169個 氨 基 酸，分 子 質量為18 124.08 u，理論等電點為8.66，分子式為C813H1325N209O244S6。對轉基因陽性植株進行測序，結果顯示，其序列與NCBI數據一致，沒有基因突變。

2.2 T0的ST6-40轉基因棉花PCR鑒定

對200棵T0轉基因植株進行PCR鑒定，共獲得65個陽性株系，轉化率為19%。如圖2所示，10個T0轉基因再生苗中，L1和L35為陰性轉基因棉花，其余為陽性轉基因棉花。進一步將獲得的T0陽性棉花再生苗嫁接到溫室內，其中有60株收獲到種子。

圖2 T0轉基因棉花PCR檢測Fig.2 PCR detection of T0 generation of transgenic cotton

2.3 穩定遺傳的后代轉基因棉花鑒定

2.3.1 T1、T2轉基因棉花鑒定對60個T1轉基因株系進行PCR鑒定（圖3），共得到48個T1的ST6-40轉基因棉花陽性株系，其中，34個T1轉基因陽性株系的脯氨酸含量高于對照，且L2、L5、L14、L18、L22、L26、L29、L47共8個株系的脯氨酸含量顯著或極顯著高于對照（P<0.05或P<0.01）（表2）。

對34個T2轉基因株系進行PCR鑒定，結果均為陽性轉基因棉花（圖3），其中31個的游離脯氨酸含量高于對照R15，且L2、L5、L14、L18、L22、L29、L55、L56共8個株系的脯氨酸含量顯著或極顯著高于對照（P<0.05或P<0.01）（表2）。

圖3 T1～T3轉基因棉花在分子水平的鑒定Fig.3 Molecular identification of T1-T3 transgenic cotton lines PCR detection and qRT-PCR detection

表2 轉基因棉花的游離脯氨酸含量及苗期鹽脅迫下的鹽害指數Tab.2 Free proline content of transgenic cotton and salt damage index in seedling stage under salt stress

2.3.2 T3轉基因棉花鑒定T1、T2連續2代游離脯氨酸含量顯著高于受體對照R15的7個株系，繼續種植收獲T3種子，經過對葉片噴草銨膦除草劑抗性鑒定及目的基因進行PCR檢測，將植株葉片均抗草銨膦、且PCR檢測均為陽性的株系確定為轉基因陽性純合株系，共篩選出6個轉基因純合系（圖3）。

T3耐鹽鑒定共鑒定6個轉基因純合株系、1個常規耐鹽品系（中99807）及1個受體品系（R15），結果如表2所示，轉基因株系及中99807鹽害指數均低于受體對照R15，其中轉基因株系L2、L5、L22、L29的鹽害指數顯著低于轉基因受體對照R15，表明轉ST6-40基因棉花株系的耐鹽性比受體對照顯著提高。與常規耐鹽品系中99807相比，有4個轉基因品系的鹽害指數較低，其中轉基因株系ST6-40-L2的鹽害指數顯著低于中99807。表明轉入ST6-40基因能有效提高棉花品種耐鹽性。

此外，對鹽脅迫下的植株生長情況進行觀察，可以看出，在苗期和花鈴期轉基因棉花植株的生長勢、萎蔫程度等方面均優于受體對照品種（圖4）。

圖4 轉基因棉花苗期、花鈴期耐鹽鑒定Fig.4 Identification of salt tolerance during seedling and bell period of transgenic cotton

3 結論與討論

近10余年來，我國轉基因抗逆棉花品種選育取得了重要進展，挖掘了EDT1等一批能明顯提高棉花品種抗旱、耐鹽性的基因[10-11]。選育了一批轉基因抗旱耐鹽棉花新品種，為我國棉花抗逆育種提供了豐富的種質資源。在棉花轉基因耐鹽育種研究方面，發掘了一批耐鹽基因，獲得了一些轉基因耐鹽棉花新材料，主要包括TsVP基因棉花、HcVP基因棉花、TaNHX2基因棉花等，以及擬南芥AtNHX1基因、大豆GmNHX1基因和百脈根LcVP1基因等。應用較多的是與代謝相關的植物轉錄調控基因，主要包括甜菜堿CMO基因、大腸桿菌的beTA基因和小鹽芥ST6-40基因等[12-15]。研究發現，在擬南芥過量表達ST6-40基因，植物根系長度、葉片及株高都有顯著提高[16-17]。本研究利用ST6-40基因構建了重組載體pCB2004-ST6-40，采用農桿菌介導法將其轉入棉花品種R15，共進行了350個轉化事件，轉化率為19%，獲得65個陽性T0株系，其中再生植株中90%為陽性苗。轉化效率及陽性率高于其他轉基因棉花，表明我們建立的遺傳轉化體系高效穩定，經過對葉片噴施草銨膦除草劑抗性鑒定及目的基因進行PCR檢測雙重篩選陽性植株的方法，確保篩選鑒定出轉基因陽性純合株系。

耐鹽鑒定基本采用測定游離脯氨酸、丙二醛等生理指標來鑒定[18-20]，本研究為獲得穩定的耐鹽轉基因棉花，對T1所獲得的48個陽性轉基因棉花進行游離氨基酸測定，發現34個的含量高于對照，進一步對其T2鑒定，31個的含量高于對照，其中連續2代的游離脯氨酸含量均顯著高于對照的是L2、L5、L14、L18、L22、L29共6個株系。此外，利用鹽脅迫下棉花植株葉片受損程度來計算鹽害指數，該方法能夠較客觀地反映鹽脅迫下棉花植株的生長狀況，篩選的的棉花材料在生產上適應性更強[21-22]。本研究對前述6個株系的T3鑒定發現，均為陽性轉基因；且鹽害指數結果表明，L2、L22、L5、L29均優于中99807，其中L2顯著優于中99807，表明轉ST6-40基因棉花品系耐鹽性較強。因此，鑒定篩選的轉基因耐鹽品系生產適應性更強[23]。

轉基因耐鹽育種作為一種高效的棉花耐鹽育種手段，本研究通過構建pCB2004-ST6-40重組載體，利用農桿菌介導法將ST6-40基因轉入棉花基因組，經耐鹽性鑒定，獲得耐鹽性顯著增強的轉基因棉花株系，為棉花耐鹽育種創制了新的種質材料，加快棉花耐鹽育種進程。此外，基于該研究已經申報并獲批了ST6-40-2等4個耐鹽性表現突出的ST6-40轉基因棉花株系的轉基因生物安全中間試驗，下一步將利用雜交、回交等常規育種技術，進一步改良這些材料的農藝性狀和產量性狀，為棉花耐鹽育種提供優異種質來源。