重金屬對煤礦區土壤線蟲群落結構的影響

成碧君，劉良坡，張紅梅，楊秀娟

（山西醫科大學 公共衛生學院，山西 太原 030001）

近年來，重金屬污染引起的生態環境問題日益增多，其中煤礦開采直接或間接地造成土壤重金屬污染。山西煤炭資源豐富，但是煤炭資源開采造成生態的嚴重破壞，煤矸石、粉煤灰等固體廢物歷史堆存總量較大，對周圍土壤造成重金屬污染和蓄積，存在環境安全隱患，影響公眾健康[1-2]。研究顯示，我國農田土壤重金屬含量最高的是Cr、As、Cu和Ni[3]，其中，Cr空間插值次高值區出現在山西[4]。何建國等[5]研究發現，皖北煤礦區土壤中As、Cr、Cu、Ni、Zn的平均含量超出安徽省土壤背景值的55%、16%、35%、18%、22%，且Zn和Cu易于遷移到小麥的籽粒中。趙穎等[6]研究發現，太原市小店區土壤重金屬Cr、Cu、Zn含量分別為44.32～130.12、55.00～252.72、20.40～70.51 mg/kg，且根莖類和瓜菜類重金屬污染處于輕度污染水平，對兒童具有潛在健康風險。重金屬是持久性的污染物，在土壤中過量沉積引起土壤質量下降，導致土壤退化、抑制土壤生物體活性、存在潛在的生態風險[7]。崔雅紅等[8]研究發現，陜西蒿坪石煤礦區土壤中Cu和Zn元素含量都已超過陜西土壤背景值，且受到Cu和Zn輕度污染，存在輕微的生態風險。魯西南地區某煤礦區土壤中Cr、Ni、Zn含量均值明顯高于山東省背景值，Ni元素存在小范圍輕度污染區域[9]。山西沁源、古交、陽泉的一項研究發現，煤矸石堆放區附近村莊土壤中As、Ni等重金屬對當地兒童早期神經發育構成潛在威脅；土壤滲濾液干擾了與斑馬魚（Danio rerio）早期神經發育相關的關鍵發育過程，導致斑馬魚幼蟲活動減退[10]。Ni和As等重金屬污染產生的毒性會降低土壤營養因子含量，破壞蜱螨類敏感土壤動物的食物鏈，使土壤動物數量減少、生物多樣性降低[11]。重金屬Ni對公路兩側螞蟻、蜈蚣、隱翅蟲（Staphvlinidae）等大型土壤動物群落結構有較大的影響[12]。?ALAMúN等[13]研究發現，Cr對于線蟲群落結構有著顯著的毒性，并且對線蟲豐度、多樣性和生態指數均產生了負面影響。侯磊等[14]初步估計，青藏高原高寒草甸內部不同區域的土壤線蟲群落結構上的差異可能與重金屬含量中Cu和Zn能刺激線蟲卵孵化過程繼而增加線蟲豐度有關。因此，了解山西煤礦區土壤重金屬污染情況及其對土壤生態系統的影響迫在眉睫。

線蟲作為最豐富的土壤無脊椎動物，是土壤生態系統的重要組分，其對環境變化反應靈敏，土壤中重金屬污染對于土壤的影響可通過線蟲分布和活性變化來診斷[15]。重金屬污染使土壤動物群落的物種多樣性降低，土壤動物密度減小，群落結構趨于簡單，土壤生態系統趨于退化[16]。隨著土壤中重金屬不斷累積，擾亂了土壤生態平衡，同時土壤線蟲的群落結構發生改變。多項研究表明，土壤線蟲可作為對重金屬污染敏感的生物指標[6-10]。XUE等[17]將秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）生長、繁殖和攝食行為的情況用于評估重金屬Cd、Pb和Mn的毒性影響。SHARMA等[18]研究分析了重金屬含量和土壤生態食物網之間的相關性，結果表明，土壤重金屬Cr的污染與土壤食細菌線蟲和食真菌線蟲呈正相關關系。以往相關研究一般采取的是人為控制試驗改變土壤中重金屬含量來觀察線蟲群落結構的反應，多關注單一金屬污染或者2種金屬元素污染在短時間內所致的線蟲群落結構變化[19-20]。然而煤礦區附近農田土壤中超標重金屬種類多，受污染時間往往在幾十年以上，對土壤生態系統造成了長期影響[21]。因此，研究多種重金屬復合污染與線蟲群落之間的關系是非常必要的。

目前對于土壤重金屬污染的評估主要基于土壤中重金屬含量[22-23]，而從土壤消費者這一角度研究重金屬污染的影響，能夠更加全面地反映重金屬污染帶來的生態風險。因此，本研究通過測定煤礦區附近農田土壤中重金屬含量，利用土壤線蟲各營養類群豐度、Shannon-Weaver多樣性指數、線蟲均勻度指數、成熟度指數、線蟲通道指數、富集指數、結構指數等分析土壤線蟲群落結構，采用冗余分析（redundancy analysis，RDA）和典型相關分析（canonical correlation analysis，CCA）探討線蟲群落結構生態指數與土壤重金屬含量之間的關系，以期從土壤生物多樣性方面研究重金屬污染情況，有效評價線蟲群落生態指數對重金屬含量反應靈敏度，旨在為山西省土壤生態評價提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 研究區概況

試驗于2018年在山西省晉中市（東經112°34′～113°8′，北緯37°23′～37°54′）北山煤礦區進行。該地屬半干旱大陸性季風氣候，海拔80 m，年平均氣溫9.8℃，降水量418～483 mm，年日照時數2 662 h，無霜期158 d。研究區域土壤類型為褐土，種植作物主要為玉米。

1.2 試驗設計

本研究隨機選取運煤公路和水源旁5個采樣區的農田土壤進行調查采樣，5個采樣區分別標記為P1、P2、P3、P4和P5。P1位于煤礦區水源附近農田，P2、P3、P4、P5分別位于運煤公路旁的農田。為排除探礦、采礦等人類活動的影響，對照區選取遠離礦區且無工業污染的一個采樣區，標記為CK。通過測定采樣區重金屬As、Cr、Ni、Cu、Zn的含量，將對照區土壤重金屬含量的平均值作為參考值，對土壤重金屬的生態風險進行評價。

1.3 土壤線蟲提取和分析

稱取100 g新鮮土樣，采用改良的淺盤法[24]分離收集土壤線蟲。利用Olympus ZX10體視顯微鏡計數線蟲總數，根據線蟲形態特征和食性于Olympus BX51光學顯微鏡100×和400×下進行分類鑒定[25]。

根據線蟲進食習性的不同及形態學上的差異，分為4種營養類群，分別為植物寄生線蟲（plant parasites nematodes，PP）、食細菌線蟲（bacterialfeeding nematodes，BF）、食真菌線蟲（fungi-feeding nematodes，FF）和 捕 食 雜 食 線 蟲（ominivores/carnivorous，O/C）[14，26-27]。

本研究應用各種指標對線蟲群落結構進行描述。

1.3.1 線蟲豐度和各營養類群相對豐度 線蟲豐度和各營養類群相對豐度是指每100 g干燥土壤樣品中的線蟲總數和某營養類群的線蟲數占線蟲總數的比例[28]。

1.3.2 Shannon-Weaver指 數（H'）和Pielou指 數（J'）Shannon-Weaver指 數 和Pielou指 數 反 映 某區域土壤線蟲營養類群和種類的多樣性。

其中，Pi是某種屬線蟲在線蟲總數中的比例，S是樣本中的線蟲種屬數量[21，28]。Shannon-Weaver指數越大，表明線蟲種屬的數量越多，線蟲多樣性越豐富[21]。Pielou指數越大，表明各線蟲種屬之間數量差別越大，線蟲群落結構越穩定[29]。

1.3.3 成熟度指數（maturity index，MI） 成熟度指數分為自由生活線蟲（捕食雜食線蟲、食細菌線蟲和食真菌線蟲）成熟度指數和植物寄生線蟲成熟度指數（plant parasites nematodes maturity index，PPI），本研究使用的成熟度指數主要針對自由生活線蟲[28]。

其中，fi是樣本中某種線蟲的個體數占線蟲總數 的 比 例；vi是 該 線 蟲 的c-p（colonizer-persister）值[28]。根據線蟲群落的生活史策略，按照殖民者-居住者的定義將線蟲賦予1～5的c-p值[27]。低MI值和高PPI值表明土壤生態系統成熟度越低，土壤生態系統擾動強烈，反之則表明土壤生態系統趨于穩定，受外界干擾影響程度越小[27-28]。

1.3.4 線蟲通道指數（nematode channel ratio，NCR）線蟲通道指數是食細菌線蟲和食真菌線蟲的比值，反映分解速率較快的基于細菌的能量通道和分解速率較慢的基于真菌的能量通道在分解過程中的相對重要性[28]。

其中，B和F分別是食細菌線蟲和食真菌線蟲的相對豐度。NCR值在1和0之間波動，NCR高 于0.5，說明土壤食物網以食細菌通道為主，土壤有機質以細菌分解途徑為主，NCR低于0.5，說明土壤食物網以食真菌通道為主，土壤有機質以真菌分解途徑為主[28]。

1.3.5 富集指數（enrichment index，EI）和結構指數（structure index，SI） 富集指數和結構指數二者相結合能夠更好地指示土壤環境受擾動的情況和土壤食物網的狀況[21]。

其中，b是食物網中的基礎成分，通常指食細菌線蟲和食真菌線蟲中c-p值為2的兩類群線蟲；e是食物網中的富集成分，指食細菌線蟲中c-p值為1和食真菌線蟲中c-p值為2的兩類群線蟲；s為食物網中的結構成分，包括c-p值為3～5的食細菌線蟲、食真菌線蟲和捕食雜食線蟲[21]。

其中，kb、ke、ks為各類群線蟲所對應的加權值（其值為0.8～5.0），nb、ne、ns為各類群線蟲的相對豐度，為各類群線蟲所對應的加權值。結構指數越高，富集指數越低，表明土壤食物網越復雜，重金屬對土壤環境擾動較小，反之則表明土壤養分呈現富集狀態，受重金屬擾動強烈[19]。

1.4 數據分析

采用R 4.1.0和SPSS Statistics 22.0軟件對數據進行統計分析，利用Excel 2016、R 4.1.0和Origin 2018進行圖表繪制。利用Kolmogorov-Smirnov檢驗判斷數據是否符合正態分布；利用Levene法判斷數據是否符合方差齊性檢驗。若數據方差齊且均顯示正態分布，則利用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）進行差異分析，利用Student-Newman-Keuls法進行兩兩比較；若數據不符合正態分布或方差不齊，則采用非參數檢驗進行差異分析，利用Kruskal Wallis秩和檢驗法進行兩兩比較。通過Canoco 5軟件進行冗余分析（RDA）和典型相關分析（CCA），找出土壤重金屬含量與線蟲群落結構指標及線蟲種屬豐度之間的相關關系。

2 結果與分析

2.1 土壤重金屬含量基本特征分析

由表1可知，污染區重金屬Cr、Cu、As、Zn的含量均與對照有顯著差異。污染區5個采樣區土壤Zn含量均顯著高于對照。與《土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準（試行）》（GB 15618—2018）[30]中篩選值相比較，P4采樣區的Zn含量是篩選值的1.82倍。對照區和污染區各采樣點的樣品As含量均超過了風險管制值，各個采樣點中土壤Cr、Ni和Cu的含量均未超過篩選值和管制值。

表1 污染區和對照區土壤各重金屬含量比較Tab.1 Comparison of heavy metal contents in soil of polluted area and control area mg/kg

2.2 土壤線蟲群落結構分析

本研究共鑒定出20個線蟲屬，其中，食細菌線蟲11屬，食真菌線蟲3屬，植物寄生線蟲4屬，捕食雜食線蟲2屬。在對照區中占優勢的線蟲屬主要有真滑刃屬、原桿屬、盤旋屬；P1區優勢線蟲屬主要是真滑刃屬、莖屬和孔咽屬；P2區優勢線蟲屬為真滑刃屬和盤旋屬；P3區優勢線蟲屬有小桿屬、中桿屬、真滑刃屬、盤旋屬、絲尾墊刃屬、孔咽屬；P4區優勢線蟲屬為真滑刃屬；P5區優勢線蟲屬是真滑刃屬、莖屬和滑刃屬（表2）。

表2 土壤線蟲的群落組成Tab.2 Community composition of nematodes in soil

污染區和對照區土壤中線蟲總數存在顯著差異，污染區線蟲總數顯著低于對照區（圖1-A）。污染區P2和P5的線蟲總數顯著低于CK和P1（表3）。采樣區CK和P3土壤中食細菌線蟲占主要優勢，P1、P4和P5土壤中占優勢的主要是食真菌線蟲，而P2中植物寄生線蟲的相對豐度最高。污染區土壤線蟲Shannon-Weaver多樣性指數（H'）和線蟲通道指數（NCR）均顯著低于對照區（圖1-D和圖1-E）。污染區各采樣區的線蟲通道指數值均顯著低于對照區，且低于0.6，說明污染區以食真菌線蟲活動較為活躍。

圖1 污染區和對照區土壤中線蟲生態評價統計Fig.1 Statistics of ecological evaluation of nematodes in polluted area and control area

表3 土壤中線蟲指標統計Tab.3 Statistics of the nematodes index in soil

2.3 土壤重金屬含量對土壤線蟲群落的影響

本研究通過冗余分析（RDA）和典型相關分析（CCA），探討土壤重金屬含量與線蟲各種屬相對豐度以及線蟲群落結構指標之間的關系，為通過線蟲群落結構來估計土壤重金屬污染程度提供理論基礎。

土壤線蟲群落指標與重金屬含量的RDA分析結果如圖2所示，研究區域內的土壤線蟲群落受重金屬Cr和Ni的影響較大，其中，食真菌線蟲相對豐度、捕食雜食線蟲相對豐度、結構指數、成熟度指數均與重金屬Zn、Cu、Ni、Cr、As含量呈負相關，植物寄生線蟲相對豐度、食細菌線蟲相對豐度、植物寄生線蟲成熟度指數、線蟲通道指數、Pielou指數均與這些重金屬含量呈正相關。重金屬Cu、Ni含量與植物寄生線蟲成熟度指數表現出較強的正相關性，與結構指數表現出較強的負相關性；重金屬Zn、As、Cr含量與植物寄生線蟲相對豐度表現出較強的正相關性，與食真菌線蟲相對豐度表現出較強的負相關性。重金屬Zn、As、Cr、Cu、Ni含量與土壤線蟲總豐度、富集指數、Shannon-Weaver指數的相關性都很低。

圖2 土壤線蟲群落指標與重金屬含量RDA分析Fig.2 RDA analysis of soil nematode community indexes and heavy metal concent

為了探究土壤重金屬污染影響的主要線蟲種屬，對污染區域的重金屬含量和土壤線蟲種屬豐度進行典范對應分析，結果如圖3所示。第1排序軸與土壤重金屬Zn、As、Cr、Cu、Ni均表現出負相關關系，與土壤Cr負相關關系最強。這說明沿著第1排序軸從左到右，土壤重金屬含量越來越高。第2排序軸與重金屬Zn、As、Ni呈負相關關系，與重金屬Cr、Cu呈正相關關系。說明沿著第2排序軸從下至上，土壤Zn含量越來越小，重金屬Cr含量逐漸增加。第2排序軸與重金屬Ni的相關性最強。通過排序軸分析，重金屬Cr、Cu含量與線蟲擬麗突屬、螺旋屬、絲尾墊刃屬、滑刃屬豐度呈正相關，與原桿屬、孔咽屬、真頭葉屬豐度呈負相關；重金屬Zn、As、Ni含量與盆咽屬、頭葉屬、真滑刃屬、繞線屬、似繞線屬、棱咽屬、擬矛線屬豐度呈正相關，與麗突屬、根結屬、盤旋屬、小桿屬、根結屬豐度呈負相關。

圖3 土壤線蟲種屬相對豐度與重金屬含量CCA分析Fig.3 CCA analysis of relative abundance of soil nematode genus and heavy metal concent

3 結論與討論

本研究結果表明，污染區5個采樣區重金屬Cr、As、Cu、Zn的含量均顯著高于對照區，而重金屬Ni污染程度與對照相比無顯著差異。羅妍等[31]研究發現，東北煤礦區表層土壤中Cr、Cu、Ni、Pb、Zn平均含量均超過了背景值0.89～1.85倍。土壤中重金屬Ni含量受到煤礦開采影響的同時，還與土壤質地、地形、氣候等自然因素控制有關[32]。對照區和污染區各采樣區的樣品As含量均超過了風險管制值，說明該礦區周邊土壤中種植的食用農產品不符合質量安全標準，農用地土壤污染風險高，原則上應當采取禁止種植食用農產品、退耕還林等嚴格管控措施[33]。

污染區線蟲總數顯著低于對照區，食細菌線蟲的相對豐度低于對照區，而食真菌線蟲和捕食雜食線蟲的相對豐度均高于對照區。重金屬污染會造成線蟲總數減少，這是由于重金屬對線蟲群落的直接毒性作用以及對線蟲營養來源消耗的間接影響[29,34]。污染區線蟲通道指數（NCR）顯著較低，其原因是污染區土壤中食真菌線蟲的數量較多，食細菌線蟲的數量較少，食細菌線蟲和食真菌線蟲的數量變化被發現與重金屬污染土壤中微生物數量有關[35]。污染區NCR值低于0.5，說明污染區土壤食物網以食真菌通道為主，土壤有機質以真菌分解途徑為主。污染區和對照區線蟲富集指數（EI）和結構指數（SI）差異不顯著，表明重金屬污染對土壤微生物和食物鏈長度的影響沒有顯著差異[36]。富集指數（EI）被用來評估食物網對可利用資源的響應，結構指數（SI）是用于揭示在人為干擾或生態恢復過程中土壤食物網結構變化的指標[28]。本研究污染區線蟲富集指數（EI）低于對照區，結構指數（SI）則高于對照區，表明污染區土壤食物網由于重金屬污染導致可利用資源和土壤養分減少。污染區Shannon-Weaver指數和Pielou指數均低于對照區，表明污染區線蟲群落多樣性降低。本研究中，污染區Shannon-Weaver指數和均勻度指數均低于對照區，表明線蟲屬數量的減少主要是由于線蟲多樣性的降低，其次是不同種屬線蟲相對豐富度的變化[29]。重金屬污染對線蟲群落的影響不僅體現在線蟲單一種屬的豐度變化，不同營養類群和c-p類群的線蟲豐度上的變化也很明顯[29]。成熟度指數（MI）是重金屬污染引起的土壤反應的良好指示指標[21]。土壤Cu、Pb、Zn含量高均對線蟲群落的成熟度有不利影響[21]。

土壤中重金屬的不斷累積，不僅使土壤質量發生了明顯改變，同時擾亂了土壤生態平衡，土壤線蟲的群落結構發生改變，從而影響農田作物的生長和產量[29，37]。本研究通過線蟲各種屬相對豐度與土壤重金屬含量的RDA分析發現，Zn、Cu、Ni、Cr、As與食真菌線蟲相對豐度均呈負相關，而與食細菌線蟲相對豐度呈正相關，表明這5種重金屬對食真菌線蟲具有抑制作用，而對食細菌線蟲存在一定的促進作用。SHARMA等[18]研究發現，As與食真菌線蟲相對豐度有較弱的負相關關系，而Cr和Zn則與食細菌線蟲相對豐度具有正相關關系，這與本研究結果一致。本研究中Zn與植物寄生線蟲相對豐度有較強的相關性，這與Zn對植物寄生線蟲拮抗菌（根瘤細菌、菌根真菌）和捕食雜食線蟲的抑制等作用有關[38]。捕食雜食線蟲與Zn、Cu、Ni、Cr和As呈負相關，這與?ALAMúN等[39]的研究結果一致。本研究中，Zn、Cu、Ni、Cr和As與土壤線蟲結構指數和成熟度指數呈較為密切的負相關關系，與線蟲通道指數和富集指數呈正相關。SáNCHEZ-MORENO等[21]和GEORGIEVA等[38]研 究發現，重金 屬Ni、Zn和Cu對線蟲群落具有毒性作用，對土壤線蟲結構指數和成熟度指數有顯著的不利影響，但對線蟲富集指數有積極影響。PARK等[29]研究表明，重金屬Cu和Ni的含量超過100 mg/kg會對自由生活線蟲成熟度指數產生負面影響。?ALAMúN等[13]研究發現，自由生活線蟲成熟度指數和結構指數與重金屬Cr含量存在明顯的負相關關系。因此，可推測土壤線蟲結構指數和成熟度指數對土壤重金屬污染的響應敏感。本研究中土壤線蟲總豐度與重金屬含量相關性不強，對于指示Zn、Cu、Ni、Cr和As污染的靈敏度較低，被認為是最不敏感的線蟲群落指標[20]。

土壤線蟲種屬與特定重金屬元素之間的關系在一定程度上受到線蟲群落結構較高變化頻率和收集數據中個別種屬缺乏的阻礙，這是研究重金屬與線蟲之間相關關系的一個重大障礙[40]。同一營養類群的不同種屬線蟲對重金屬污染的反應不同；CCA分析發現，重金屬Zn、As、Ni與食細菌線蟲頭葉屬、繞線屬、似繞線屬、棱咽屬豐度呈正相關，而與食細菌線蟲麗突屬、小桿屬豐度呈負相關，推測特定種屬對于重金屬含量的反應不是單一種屬線蟲的體現，而是土壤生態系統和線蟲群落的綜合體現[40]。重金屬污染對線蟲豐富度和多樣性均有負面影響，線蟲群落功能冗余的殘存可使得線蟲結構指數回升，使污染區的生態實現自我調整[21]。通過RDA分析各重金屬含量和線蟲群落指標的結果發現，重金屬Zn、Cu、Ni、Cr和As與土壤線蟲結構指數和成熟度指數呈較強的負相關關系，可作為線蟲群落指示土壤重金屬污染的合適指標[39]。

本研究結果表明，山西省某煤礦區土壤As含量大于風險管制值，超過土壤環境質量的風險管控標準，應予以重點關注；重金屬污染造成土壤線蟲總數顯著降低；Cr和Ni對土壤線蟲群落結構影響最大，土壤線蟲結構指數和成熟度指數可作為指示土壤重金屬污染的指標。