晉產(chǎn)蒼耳葉提取物的抗菌活性及其主要抗菌組分

宋麗麗，梁 靜，魏思琪，李 楊，楊 春，曹 揮，郅曉燕

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西 太谷 030801）

到目前為止，盡管傳統(tǒng)合成農(nóng)藥在有害生物綜合治理中仍扮演著重要角色，但不可忽視的是其在長期使用過程中暴露出農(nóng)產(chǎn)品殘留、環(huán)境污染以及有害生物抗藥性加劇等問題卻愈發(fā)突出[1-2]，嚴(yán)重影響了我國農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全和農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境。因此，伴隨著國家“雙減”行動的實施，通過自主創(chuàng)制綠色生態(tài)農(nóng)藥，推動綠色農(nóng)藥替代傳統(tǒng)合成農(nóng)藥，最終實現(xiàn)農(nóng)藥減量控害已成為解決上述問題的關(guān)鍵措施[3-4]。與此同時，植物次生代謝物質(zhì)常被視為進(jìn)行新農(nóng)藥開發(fā)的重要來源之一，絕大多數(shù)植物次生代謝產(chǎn)物是植物在其生命過程中產(chǎn)生抵御外界有害生物（昆蟲、病原微生物及食草動物等）入侵的重要化學(xué)防御物質(zhì)，具備活性優(yōu)異、環(huán)境兼容性好、易于降解、作用機制特異以及有害生物不易產(chǎn)生抗藥性等諸多優(yōu)點[5-6]。因此，發(fā)掘具有重要農(nóng)用生物活性的植物次生代謝產(chǎn)物，已成為現(xiàn)階段創(chuàng)制綠色生態(tài)農(nóng)藥的一條有效途徑[3]。

蒼耳（Xanthium sibiricumPatr.Ex Widd）屬菊科（Asteraceae）蒼耳屬1年生草本植物。在世界范圍內(nèi)約有30余種，主要分布于美洲大陸、歐洲、非洲北部以及亞洲大部分地區(qū)[7-8]。我國境內(nèi)現(xiàn)共發(fā)現(xiàn)蒼耳屬植物4種2變種，其中，蒼耳（原變種）的適應(yīng)性最強，各種環(huán)境都能生長，因此，廣泛分布于全國各地，資源十分豐富。蒼耳作為一種傳統(tǒng)的藥用植物，其全株均有藥用價值，尤其以地上部分用途最廣，蒼耳干燥成熟帶總苞的果實就是我國的一味傳統(tǒng)中藥蒼耳子（Fructus xanthii）。由于蒼耳巨大的藥用價值和廣泛的生物活性，也引起了各國學(xué)者的研究興趣。

關(guān)于蒼耳中抗菌組分的研究，最早起源于人們對蒼耳植物粗提物抗菌作用的認(rèn)識。馮俊濤等[9]研究發(fā)現(xiàn)，蒼耳丙酮提取物對番茄灰霉病菌（Botrytis cirerea）和辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）的抑制率分別達(dá)到96.8%和97.2%。吳光旭等[10]采用生長速率法和懸滴法分別測定0.01 g/mL蒼耳甲醇提取物對荔枝霜疫霉菌（Peronophythora litchii）和香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）的菌絲生長和孢子萌發(fā)抑制率，發(fā)現(xiàn)其對2種病原菌的菌絲生長與孢子萌發(fā)抑制率均大于50%。丁維成等[11]采用生長速率法測定蒼耳葉提取物對小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、大豆鐮刀病菌（Fusarium oxysporum）、玉米小斑病菌（Cochliobulusheterostrophus）的EC50分別為0.006 0、0.006 9、0.007 3 g/mL。此外，國內(nèi)學(xué)者還研究了蒼耳不同溶劑提取物對植物病原菌的抑制作用，結(jié)果顯示，蒼耳提取物對大多數(shù)病菌均有較強的抑制作用[12-13]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者開始對蒼耳中的倍半萜內(nèi)酯類活性成分產(chǎn)生了濃厚興趣。劉學(xué)年等[14]制備的20%蒼耳素乳油植物性殺菌劑已經(jīng)在大田實際應(yīng)用，通過田間藥效試驗表明，其對蘋果斑點落葉病的防效十分突出。張文治等[15-16]研究了蒼耳全草的化學(xué)成分，利用生長速率法發(fā)現(xiàn)分離得到的部分化合物對供試菌表現(xiàn)出較好的抑菌作用。胡冬燕[17]研究了蒼耳地上部分提取物的抗菌作用，并從中分離得到倍半萜類化合物蒼耳亭，采用生長速率法測定其對供試菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)蒼耳亭對供試菌表現(xiàn)出較強的抑制生長作用。LAVAULT等[18]從菊科蒼耳屬植物Xanthium macrocarpum的果實和葉子提取物中分離出蒼耳亭，研究表明其具有抗真菌和抗利什曼原蟲活性。SAHA等[19]研究表明，通過田間試驗測定印度產(chǎn)蒼耳葉提取物中的蒼耳亭對茶葉葉面病害的防控效果，結(jié)果表明，其對數(shù)十種病害均有一定的防治效果。付寶春等[20]以含蒼耳子的5種中草藥混合浸提物測試了對果樹腐爛病菌的防治效果，結(jié)果表明，其最終防效優(yōu)于常用的化學(xué)藥劑。綜上，目前對蒼耳抗菌作用研究多數(shù)集中在全草或地上部分粗提物對真菌菌絲生長的抑制活性，而且并未深入研究其對多種病原菌的抑菌毒力和孢子萌發(fā)抑制活性。對于蒼耳中的抗菌成分及其對植物病原真菌菌絲生長抑制作用只做了簡單報道，但對蒼耳葉中主要抗菌活性成分及其對植物病原菌的抑菌毒力和抑制孢子萌發(fā)作用的深入研究鮮有報道。

本試驗以蒼耳葉為研究材料，對其主要抗菌組分進(jìn)行分離，同時系統(tǒng)測試了該抗菌組分對植物病原真菌菌絲和孢子的抑制活性，旨在為進(jìn)一步開發(fā)新型綠色植物源抗菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料蒼耳嫩葉采自晉中市太谷區(qū)太谷西站附近，經(jīng)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院王瑞云教授鑒定為菊科蒼耳屬植物蒼耳（Xanthium sibiricum）。

供試藥品及試劑：95%乙醇，乙酸乙酯，石油醚（沸程60～90℃），二氯甲烷，柱層析硅膠（0.050～0.074 mm），丙酮，葡萄糖，瓊脂粉和吐溫-80等均為市售分析純；多菌靈、惡霉靈和苯醚甲環(huán)唑原藥（≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

供試植物病原菌有玉米圓斑病菌（Bipolariscarbonum）、蘋果樹腐爛病菌（Valsa mali）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、蘋果炭疽病菌（Collectotrichum gloeosporioides）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、腐皮鐮刀病 菌（Fusarium solani）和黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）。以上病原菌菌種均保藏于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院118實驗室，活化后即可使用。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料的預(yù)處理7—8月采集蒼耳嫩葉洗凈，室內(nèi)陰干，粉碎后過0.250 mm篩，得到的植物材料干粉密封后置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蒼耳葉乙醇粗提物的制備 將1.2.1制得的植物材料干粉裝入浸提缸內(nèi)，加入95%乙醇，充分?jǐn)嚢韬髮⑻崛「字糜诔暡ㄌ崛x中（30℃）超聲波輔助提取1 h，取出后室溫條件下浸提3 d。抽濾，濾渣再次裝入提取缸中，重復(fù)上述操作2次。合并濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后得到蒼耳葉乙醇粗提物。

1.2.3 蒼耳葉乙醇粗提物2種溶劑萃取組分的制備 將蒼耳葉乙醇粗提物加入石油醚萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后得到石油醚萃取組分。再將水相繼續(xù)用乙酸乙酯萃取，操作過程同上，最終制備得到乙酸乙酯萃取組分。

1.2.4 蒼耳葉中主要抗菌組分的分離 采用反復(fù)硅膠柱層析技術(shù)對乙酸乙酯萃取組分中的抗菌物質(zhì)進(jìn)行分離，得到白色晶體（分離率約0.215 5%），將該白色晶體進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和抗菌活性測試。

1.2.5 供試樣品對真菌菌絲的抑制試驗 稱取一定量的蒼耳葉粗提物、乙酸乙酯和石油醚萃取組分以及分離得到的白色晶體，加入少量的丙酮溶解，再用事先配制的0.1%吐溫-80水溶液稀釋至適宜濃度備用。陽性對照藥劑為多菌靈和惡霉靈藥液。將活化好的病原菌制成4 mm的菌餅，接入帶毒培養(yǎng)基的中央，適宜條件下（溫度（25±1）℃，濕度60%～80%）培養(yǎng),于72、96 h時測量各菌落的直徑，計算抑菌率。

1.2.6 蒼耳葉中主要抗菌組分對真菌孢子的抑制萌發(fā)活性測定稱取分離得到的白色晶體，配制樣品溶液，并以惡霉靈和苯醚甲環(huán)唑為陽性對照藥劑；然后將配制好的樣品溶液與孢子懸浮液（番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、腐皮鐮刀病菌和黃瓜炭疽病菌）等體積混勻至所需的濃度，質(zhì)量濃度梯度為1 000、500、200、100、50、25、10、1、0.1μg/mL。置于適宜溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（番茄灰霉病菌孢子：（20±1）℃下培養(yǎng)7 h；番茄早疫病菌、腐皮鐮刀病菌和黃瓜炭疽病菌孢子：（25±1）℃下培養(yǎng)3～6 h），以無菌水作為空白對照。當(dāng)空白對照的孢子萌發(fā)率大于90%時，統(tǒng)計并計算各處理的孢子萌發(fā)率以及校正孢子萌發(fā)抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過Microsoft Excel 2003和SPSS Statistics 20.0軟件統(tǒng)計分析抑菌活性中的EC50等值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒼耳地上部分主要抗菌組分的結(jié)構(gòu)表征

通過核磁共振波譜和高分辨率質(zhì)譜等技術(shù)，對分離得到的主要抗菌組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，將其主要理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)同文獻(xiàn)[21-22]報道的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，可以斷定分離得到的主要抗菌組分為倍半萜內(nèi)酯類化合物蒼耳亭。

2.2 蒼耳葉乙醇粗提物對3種植物病原真菌的抑菌活性

蒼耳葉乙醇粗提物對3種植物病原真菌的抑菌活性如表1所示。

表1 蒼耳葉乙醇粗提物對3種植物病原真菌的抑菌活性Tab.1 Antifungal activity of ethanol crude extract from the leaves of Xanthium sibiricum against three plant pathogenic fungi

從表1可以看出，隨著蒼耳葉乙醇提取物質(zhì)量濃度的增加，其對植物病原真菌抑菌率呈依賴性增長。4.0 mg/mL的蒼耳葉乙醇粗提物對3種供試真菌菌絲均有一定的抑制生長作用。尤其對玉米圓斑病菌的抑菌活性最突出，96 h抑菌率接近80%，這也證實了蒼耳葉含有豐富的抗菌活性物質(zhì)。

2.3 蒼耳葉乙醇提取物不同萃取組分的抗菌活性

由表2可知，在2種供試濃度下，對5種供試菌的抑菌率總是乙酸乙酯萃取組分優(yōu)于石油醚萃取組分。4.0 mg/mL的乙酸乙酯萃取組分對蘋果炭疽病菌和番茄灰霉病菌的抑菌率高達(dá)90%以上，而同質(zhì)量濃度下石油醚萃取組分對蘋果炭疽病菌和番茄灰霉病菌的抑菌率分別為67%和73%，蒼耳葉的抗菌組分主要分布在乙酸乙酯相。據(jù)此可以推測，蒼耳葉中含有的抗菌組分主要為極性物質(zhì)，采用不同溶劑萃取時大多會富集在極性溶劑中。

表2 蒼耳葉乙醇粗提物不同萃取組分對5種植物病原真菌的抑菌活性Tab.2 Antifungal activity of different extraction components of ethanol crude extract from the leaves of Xanthium sibiricum against five plant pathogenic fungi

2.4 蒼耳亭對6種供試植物病原真菌的毒力分析

蒼耳亭對6種供試植物病原真菌抑制活性如表3所示。

表3 蒼耳亭對6種供試植物病原真菌抑制活性Tab.3 Antifungal activity of xanthatin against six tested plant pathogenic fungi

由表3可知，蒼耳亭對6種供試病原菌均有一定的抑制作用。其中，對玉米圓斑病菌、辣椒枯萎病菌、小麥赤霉病菌、腐皮鐮刀病菌和黃瓜炭疽病菌的EC50均在30μg/mL左右，顯示出良好的抑菌活性，但與陽性對照藥劑惡霉靈或多菌靈相比，其抑菌作用仍有一定的差距。此外，蒼耳亭對番茄早疫病菌的抑菌作用較弱，EC50僅207.82μg/mL。綜上可以發(fā)現(xiàn)，盡管與傳統(tǒng)合成抗菌劑相比蒼耳亭的抑菌活性并不是特別突出，但是作為植物源抗菌劑來說，其已具備抑菌譜廣泛、活性良好等優(yōu)點，說明此化合物具有進(jìn)一步改造開發(fā)成新型抗菌劑的潛力。

由圖1可知，同空白對照相比，不同質(zhì)量濃度的蒼耳亭對各種病原菌均有一定的抑制作用，隨著質(zhì)量濃度的不斷增加，對5種植物病原菌的抑菌率逐漸增大，尤其是高質(zhì)量濃度下的抑菌作用尤為明顯。這也直接證明了蒼耳亭具有廣譜和高效的抑菌活性，確為蒼耳中的有效抗菌組分，為以后蒼耳活性成分的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

圖1 蒼耳亭對植物病原真菌的抑制效果Fig.1 Antifungal activity of xanthatin against plant pathogenic fungi

2.5 蒼耳亭對4種植物病原真菌孢子的抑制萌發(fā)活性

由表4可知，蒼耳亭對供試真菌的孢子均表現(xiàn)出優(yōu)異的抑制萌發(fā)作用，且優(yōu)于2種陽性對照藥劑。尤其是對腐皮鐮刀病菌（EC50=78.00μg/mL）和番茄灰霉病菌（EC50=15.22μg/mL）孢子的抑制活性最為突出，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了陽性對照藥劑。基于上述結(jié)果，可以推斷蒼耳亭具有開發(fā)為真菌孢子萌發(fā)抑制劑的巨大潛力。

表4 蒼耳亭對4種植物病原真菌孢子的抑制萌發(fā)活性Tab.4 The inhibitory activities of xanthatin against spore germination of four phytopathogenic fungiμg/mL

從圖2可以看出，與空白對照相比，蒼耳亭對番茄灰霉病菌孢子具有強烈的抑制萌發(fā)作用，甚至優(yōu)于陽性對照藥劑惡霉靈。這也更近一步說明蒼耳亭不僅擁有良好的抑制真菌菌絲生長活性，還具有強烈的抑制真菌孢子萌發(fā)的作用，是一種潛在的綠色植物源抗菌劑。

圖2 蒼耳亭對番茄灰霉病菌孢子的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of xanthatin on the spore of Botrytis cinerea

3 結(jié)論與討論

通過發(fā)掘具有農(nóng)用生物活性的植物次生代謝產(chǎn)物，已成為現(xiàn)階段創(chuàng)制綠色植物源農(nóng)藥的一條有效途徑。首先，通過對蒼耳葉乙醇粗提物對3種植物病原真菌的抑菌活性的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著粗提物質(zhì)量濃度的增大，其對3種病原菌的抑制作用逐漸增強，由此說明，蒼耳葉中含有豐富的抗菌活性物質(zhì)。其次，對蒼耳葉乙醇不同萃取組分的抑菌活性測定時發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為0.5、4.0 mg/mL時，蒼耳葉乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分對5種病原真菌的抑菌作用都要高于石油醚萃取組分。通過提取、純化蒼耳葉中的有效抗菌成分，并經(jīng)多種現(xiàn)代有機分析手段對其結(jié)構(gòu)予以鑒定，其主要抗菌組分為倍半萜內(nèi)酯類化合物蒼耳亭，蒼耳亭不僅對供試植物病原真菌菌絲顯示出良好的抑制活性，而且對真菌孢子表現(xiàn)出強烈的抑制萌發(fā)作用，尤其對腐皮鐮刀病菌和番茄灰霉病菌孢子的抑制活性最為突出，其抑制中濃度分別為78.00、15.22μg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于陽性對照藥劑。綜上可以得出，蒼耳亭具備進(jìn)一步開發(fā)成植物源抗菌劑或以其為先導(dǎo)結(jié)構(gòu)開發(fā)成新型抗菌劑的巨大潛力。

此外，雖早有文獻(xiàn)[11-13]報道蒼耳的抑菌活性，但都只研究了蒼耳粗提物的抗菌活性，缺乏對蒼耳中具體抗菌活性成分的認(rèn)識。本試驗不僅研究其粗提物的活性，還對蒼耳中的主要抗菌組分進(jìn)行了分離鑒定，確定主要活性組分為蒼耳亭。近年來，相關(guān)學(xué)者研究了蒼耳的化學(xué)成分及其抗菌活性，但多數(shù)研究主要針對蒼耳全草或蒼耳的地上部分，而且均只研究了蒼耳中分離的活性組分對真菌菌絲的抑制作用。張文治等[15-16]報道了從蒼耳全草中分離出一些化合物，并得到了蒼耳亭，但蒼耳亭的分離率很低，同時測定了分離得到的化合物在單一供試濃度下對真菌菌絲的抑制活性，發(fā)現(xiàn)蒼耳亭的活性較突出，但缺乏對蒼耳亭抑菌毒力和抑制孢子萌發(fā)活性的詳細(xì)研究。吳光旭等[10]研究發(fā)現(xiàn)，0.01 g/mL蒼耳甲醇提取物對荔枝霜疫霉菌和香蕉炭疽病菌孢子萌發(fā)抑制率大于50%。本研究通過對蒼耳亭的抑制孢子萌發(fā)活性測定發(fā)現(xiàn)，其對黃瓜炭疽孢子萌發(fā)的EC50僅為49.84μg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蒼耳甲醇粗提取物的抑制活性。LIU等[23]研究表明，菊科植物的抗菌或殺蟲活性成分主要富集于植物的幼嫩組織中，尤其以嫩葉中含量最高。因此，本研究以蒼耳葉作為研究對象，對其主要抗菌活性組分分離鑒定，發(fā)現(xiàn)其主要活性組分為蒼耳亭，其對植物病原菌的抑菌毒力和抑制其孢子萌發(fā)都有較高的活性，但對其具體抑菌機制尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

綜上，本研究以較高的分離率（>0.2%）從蒼耳嫩葉中得到大量的倍半萜類抗菌活性組分蒼耳亭，并首次報道了蒼耳亭對植物病原真菌孢子的抑制萌發(fā)活性，填補了國內(nèi)此領(lǐng)域的研究空白，為尋找新型植物源抗菌劑提供了思路和理論依據(jù)。