適宜施氮量對粗齒冷水花根際微域土壤磷組分及磷酸酶活性的影響

張明華，李金星，戴文穎，李廷軒，葉代樺*

（1 四川農(nóng)業(yè)大學資源學院，四川成都 611130；2 四川省生態(tài)環(huán)境科學研究院，四川成都 610000；3 成都環(huán)境創(chuàng)新科技有限公司，四川成都 610000）

利用植物修復技術(shù)提取土壤過剩磷能有效防控磷流失，降低磷素非點源污染風險。然而，現(xiàn)有的磷富集植物普遍生物量小、磷積累量較低，對土壤過剩磷的提取能力有限[1]。研究表明，適宜施氮量能提高植物對磷的吸收積累能力，減少土壤對磷的固定[2–3]。施氮亦可顯著提高狗牙草 (Cynodon dactylon)[1]、百喜草 (Paspalum natatum)[4]、水蓼 (Polygonum hydropiper)[5]等磷富集植物的生物量和磷含量，有效降低表層土壤過剩的磷。目前，關(guān)于施氮促進磷富集植物磷吸收積累能力的研究較多，但相關(guān)機理研究缺乏。

土壤磷組分可全面表征土壤磷素狀況，磷組分之間的轉(zhuǎn)化直接影響磷的有效性，根際土壤磷有效性高低對植物磷的吸收積累能力影響較大，H2OP和NaHCO3-P是植物有效性高的磷組分，NaOHP為中活性磷組分，而HCl-P和殘渣態(tài)磷的植物有效性較低[6–7]。植物主要吸收利用土壤H2O-P和NaHCO3-Pi (Pi，無機磷)，對其他磷組分的利用能力較弱[7]。水稻在生長發(fā)育中根際土壤H2O-P和NaHCO3-Pi均有明顯的虧缺現(xiàn)象[8]，油菜在生長后期根際土壤NaHCO3-Pi含量也明顯降低[9]。施氮也能改變土壤磷的有效性，從而影響植物對磷的吸收效率[10–11]。土壤有機磷(Po)組分通常需礦化分解成有效性更高的磷組分才能被植物吸收利用。磷酸酶在土壤有機磷的礦化過程中扮演重要角色，其活性增加可促進土壤有機磷水解，為植物提供更多可利用性無機磷[12–14]。因此，研究植物根際土壤磷組分和土壤磷酸酶活性的變化，對明晰施氮促進磷富集植物提取土壤過剩磷具有重要意義。

前期研究發(fā)現(xiàn)，粗齒冷水花 (Pilea sinofasciata)具有良好的磷富集能力，且礦山生態(tài)型磷積累能力強于非礦山生態(tài)型；高磷800 mg/kg條件下，施氮140 mg/kg可顯著提高礦山生態(tài)型粗齒冷水花磷積累量[15]，為適宜施氮量。然而，適宜施氮處理下，粗齒冷水花根際土壤磷組分及磷酸酶活性的變化特征及其與磷富集的關(guān)系尚不清楚。基于此，本研究以磷富集植物粗齒冷水花為研究對象，采用多隔層根箱土培試驗，探討適宜施氮處理下兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤磷組分和磷酸酶活性的變化，以期完善適宜施氮促進磷富集植物的富磷機理，為后期合理利用粗齒冷水花提取土壤過剩磷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物：粗齒冷水花 (Pilea sinofasciata)，礦山生態(tài)型 (mining ecotype, ME)采自四川省什邡市磷礦區(qū) (104°50′E, 30°25′N)，非礦山生態(tài)型 (non-mining ecotype, NME)采自雅安市雨城區(qū) (102°59′E, 29°58′N)。

供試土壤為灰潮土，采自四川省都江堰市，基本理化性質(zhì)：pH 7.4、有機質(zhì)24.1 g/kg、全氮1.19 g/kg、堿解氮 42 mg/kg、有效磷 14.3 mg/kg、速效鉀36 mg/kg。

供試肥料：尿素 (N 46.67%)、磷酸二氫鉀 (P2O552.1%; K2O 34.6%)，均為分析純。

1.2 試驗設計與處理

試驗設磷處理中磷質(zhì)量濃度為P 800 mg/kg，氮處理中氮質(zhì)量濃度為 N 0 (CK)和 140 mg/kg，每處理重復4次，共16盆，完全隨機排列。采用自制多隔層根箱土培試驗，根箱設計參照He等[16]和Li等[17]的方法并進行改良，如圖1。該裝置用黑色PVC板和孔徑為25 μm尼龍網(wǎng)加工制成，大小為200 mm×150 mm×200 mm (長×寬×高)，由 1 個根室、10 個微域和2個土壤室組成，根室、微域和土壤室分別寬30、2和75 mm。土壤風干壓碎后過篩，將磷源配成溶液一次性施入土壤，充分混勻，陳化8周，幼苗移栽前3天將尿素配成溶液施入土壤，混勻后裝入根箱，每箱裝土6 kg，供植株生長的根室裝土1 kg，其余均勻分裝到各微域和土壤室。

圖1 多隔層根箱示意圖Fig.1 Schematic representation of the multiple compartments rhizobox

粗齒冷水花幼苗的扦插管理采用劉霜等[18]的方法，待幼苗生長40天后，選擇長勢相對一致的幼苗移栽至根箱根室中，每盆種兩株。采用自然光照，每周澆水2～3次，濕度保持田間持水量的70%。試驗在四川農(nóng)業(yè)大學教學科研園區(qū)有防雨設施的網(wǎng)室中進行。

1.3 樣品采集與制備

于移栽后9周采集樣品，將植株從根室中輕輕移出，采用抖根分離法收集附著于根系表面的土壤作為根際土壤 (R0)。植物樣品先用自來水沖洗干凈再用蒸餾水潤洗，洗凈后用吸水紙擦干，分為地上部和地下部后裝袋，于105℃條件下殺青30 min，75℃烘干至恒重，粉碎后用于磷含量測定。根際微域土壤樣品由近到遠依次采集距根室 0—2 mm (R0–2)、2—4 mm (R2–4)、4—6 mm (R4–6)、6—8 mm (R6–8)和8—10 mm (R8–10)的土壤，將相同微域土壤混勻作為1個混合樣；然后將2個土壤室中距根室較遠的土壤混勻，收集小部分作為非根際土壤 (Bs)。一部分土壤樣品自然風干，用于土壤磷組分測定；另一部分保存于–20℃冰箱，用于土壤磷酸酶活性測定。

1.4 測定項目及方法

植株磷含量采用HNO3微波消解—釩鉬黃比色法測定[19]；土壤基本理化性質(zhì)采用常規(guī)分析方法測定[19]；土壤有效磷含量采用 0.5 mol/L NaHCO3(pH 8.5)溶液浸提后鉬銻抗比色法測定[19]；土壤速效鉀含量采用1 mol/L醋酸銨浸提后用火焰光度計測定[19]；土壤磷組分采用改進后的Hedley等[20]和Tiessen等[21]的方法測定；土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性采用微孔板熒光法測定[22]；土壤植酸酶活性參考Ramesh等[23]的方法測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS (27.0)進行統(tǒng)計分析，選擇LSD法進行多重比較，用 Excel (2013)和 Origin (8.0)進行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 高磷條件下適宜施氮量對粗齒冷水花生物量、磷含量和磷積累量的影響

由表1可知，適宜施氮量下兩種生態(tài)型粗齒冷水花地上部、地下部生物量和磷積累量均顯著高于對照，其中礦山生態(tài)型地上部、地下部生物量分別較對照增加56.88%和86.04%，磷積累量分別較對照增加72.36%和90.54%；非礦山生態(tài)型地上部、地下部生物量分別較對照增加76.09%和68.75%，磷積累量分別較對照增加78.82%和68.85%。礦山生態(tài)型生物量和磷積累量顯著高于非礦山生態(tài)型，其地上部和地下部生物量分別為非礦山生態(tài)型的1.28和1.78倍，磷積累量分別為非礦山生態(tài)型的1.45和1.71倍。不施氮與適宜施氮處理下，兩種生態(tài)型地上部和地下部磷含量變幅較小，分別介于5.48～6.29和6.78～7.33 g/kg。表明高磷條件下適宜施氮量促進了粗齒冷水花生長和磷富集，尤其是礦山生態(tài)型。

表1 施氮對兩種生態(tài)型粗齒冷水花生物量、磷含量和磷積累量的影響Table 1 Effects of N application on biomass, P concentration and P accumulation of two ecotypes of P.sinofasciata

2.2 高磷條件下適宜施氮對粗齒冷水花根際微域土壤磷組分的影響

2.2.1 水提取態(tài)磷 土壤H2O-P有效性較高，極易被植物吸收利用，其含量變化如圖2。不施氮和適宜施氮處理下，兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤H2O-P含量均隨著距根室距離的增加先逐漸降低后趨于穩(wěn)定。與不施氮相比，適宜施氮可增加兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤H2O-P含量，且H2OP在距根際4 mm微域內(nèi)富集，其含量均顯著高于非根際土壤。

圖2 兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤H2O-P含量的變化Fig.2 Changes in concentrations of H2O-P in rhizosphere microdomain soil of two ecotypes of P.sinofasciata

2.2.2 碳酸氫鈉提取態(tài)磷 由圖3可知，隨著距根室距離增加，兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤NaHCO3-Pi含量先降低后趨于穩(wěn)定，NaHCO3-Po含量則逐漸增加。與不施氮相比，適宜施氮增加了兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際土壤NaHCO3-Pi含量，而NaHCO3-Po含量降低。適宜施氮處理下，礦山生態(tài)型和非礦山生態(tài)型根際微域土壤NaHCO3-Pi含量分別在距根際4和2 mm微域內(nèi)顯著高于非根際土壤，NaHCO3-Po含量分別在距根際6和8 mm微域內(nèi)顯著低于非根際土壤。不施氮和適宜施氮處理下，礦山生態(tài)型根際土壤NaHCO3-Pi含量顯著低于非礦山生態(tài)型，分別為非礦山生態(tài)型的85.12%和85.27%，而NaHCO3-Po含量在兩種生態(tài)型之間無顯著差異，表明礦山生態(tài)型對根際土壤NaHCO3-Pi利用能力更強。

圖3 兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤 NaHCO3-Pi和 NaHCO3-Po含量的變化Fig.3 Changes in concentrations of NaHCO3-Pi and NaHCO3-Po in rhizosphere microdomain soil of two ecotypes of P.sinofasciata.

2.2.3 氫氧化鈉提取態(tài)磷 由圖4可知，隨著距根室距離增加，兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤NaOH-Pi和NaOH-Po含量逐漸增加，但適宜施氮對根際土壤NaOH-Pi和NaOH-Po含量無明顯影響。適宜施氮處理下，礦山生態(tài)型和非礦山生態(tài)型根際微域土壤NaOH-Pi含量分別在距根際6和8 mm微域內(nèi)顯著低于非根際土壤；根際微域土壤NaOH-Po含量均在距根際6 mm微域內(nèi)顯著低于非根際土壤。不施氮和適宜施氮處理下，根際微域土壤NaOH-Pi和NaOH-Po含量在兩種生態(tài)型間均無顯著差異。

圖4 兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤NaOH-Pi和NaOH-Po含量的變化Fig.4 Changes in concentrations of NaOH-Pi and NaOH-Po in rhizosphere microdomain soil of two ecotypes of P.sinofasciata

2.2.4 鹽酸提取態(tài)磷和殘渣態(tài)磷 由表2可知，不施氮與適宜施氮處理下，兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤HCl-Pi、HCl-Po和Residual-P相對穩(wěn)定，其中HCl-Pi、HCl-Po含量無明顯變化，而礦山生態(tài)型根際土壤Residual-P含量在適宜施氮處理下顯著低于非根際土壤。

表2 兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤HCl-P和Residual-P含量的變化Table 2 Changes in concentrations of HCl-P and Residual-P in rhizosphere microdomain soil of two ecotypes of P.sinofasciata

2.3 高磷條件下適宜施氮對粗齒冷水花根際微域土壤磷酸酶活性的影響

2.3.1 土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶 由圖5可知，隨著距根室距離的增加，兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均呈現(xiàn)下降趨勢。與不施氮相比，適宜施氮增加了兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性，礦山生態(tài)型根際微域土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性分別在距根際6和2 mm微域內(nèi)顯著高于非根際土壤；非礦山生態(tài)型根際微域土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均在距根際4 mm微域內(nèi)顯著高于非根際土壤。適宜施氮處理下，礦山生態(tài)型根際土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性分別為不施氮處理的1.15和1.33倍；非礦山生態(tài)型根際土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性分別為不施氮處理的1.18和1.33倍。

圖5 兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性變化Fig.5 Changes in activities of acid phosphatase and alkaline phosphatase in rhizosphere microdomain soil of two ecotypes of P.sinofasciata

2.3.2 土壤植酸酶 由圖6可知，不施氮與適宜施氮處理下，兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤植酸酶活性隨著距根室距離增加均呈現(xiàn)下降趨勢，在距根際8 mm微域內(nèi)土壤植酸酶活性顯著高于非根際土壤。適宜施氮處理下，兩種生態(tài)型粗齒冷水花各微域土壤植酸酶活性均高于不施氮處理，距根際4—10 mm微域內(nèi)礦山生態(tài)型土壤植酸酶活性顯著高于非礦山生態(tài)型。適宜施氮增加了兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤的植酸酶活性，礦山生態(tài)型根際微域土壤植酸酶活性更高。

圖6 兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤植酸酶活性變化Fig.6 Changes in activities of phytase in rhizosphere microdomain soilof two ecotypes of P.sinofasciata

3 討論

3.1 適宜施氮對粗齒冷水花根際微域土壤磷組分的影響

植物對土壤過剩磷的修復效果取決于植物地上部的磷積累量，也受植株根際土壤磷有效性的影響，根際土壤磷組分變化反映了植物對土壤磷的利用情況[7]。本研究采用修訂的化學連續(xù)浸提法測定土壤磷組分，將土壤磷組分根據(jù)化學浸提劑的不同分為5大類[20–21]，其中 H2O-P植物有效性最高，能被植物直接吸收利用；NaHCO3-P有效性較高，其中NaHCO3-Pi通常吸附在土壤表面容易被根系獲取，NaHCO3-Po主要是活性較高且易被礦化分解的有機磷。土壤中H2O-P和NaHCO3-Pi含量與植物的生長和磷含量呈正相關(guān)關(guān)系，其含量的多少直接影響著植物對磷素的吸收能力[24]。白羽扇豆[25]、水稻[8]和蠶豆[26]對土壤H2O-Pi和NaHCO3-Pi具有較好的吸收利用能力，其根際土壤H2O-Pi和NaHCO3-Pi含量顯著低于非根際土壤，大麥根表也出現(xiàn)了H2OP和NaHCO3-Pi的損耗[27]。然而，本研究中高磷條件下適宜施氮卻增加了粗齒冷水花距根際4 mm微域內(nèi)土壤H2O-P和NaHCO3-Pi含量，且顯著高于非根際土壤，根際并未出現(xiàn)虧缺現(xiàn)象，這可能是在高磷條件下施氮時粗齒冷水花對H2O-P 和NaHCO3-Pi的吸收量低于其他磷組分轉(zhuǎn)化為 H2O-P和NaHCO3-Pi的總量，因此出現(xiàn)根際富集現(xiàn)象。另外本研究中兩種生態(tài)型根際土壤NaHCO3-Po礦化水解程度劇烈，其含量降低，距根際6 mm微域內(nèi)土壤NaHCO3-Po含量顯著低于非根際土壤 (圖3)，這可能與根系分泌物有關(guān)。施氮可通過增加植物根系分泌物含量，使根系周圍土壤生物化學特性不同于非根際土壤[28]，有助于根際土壤有機磷的礦化分解，分解后的土壤有機磷補充了H2O-P和NaHCO3-Pi的含量。研究發(fā)現(xiàn)，在高磷條件下增施氮肥可以增加植物的生物量，亦能提高植物對磷的吸收積累能力[1,5]。本研究中，高磷條件下適宜施氮使得兩種生態(tài)型粗齒冷水花生物量和磷積累量均顯著高于不施氮處理，這與前人研究結(jié)果相似，說明高磷條件下適宜施氮也能提高粗齒冷水花對土壤中磷的提取能力。此外本研究中適宜施氮處理下礦山生態(tài)型根際土壤NaHCO3-Pi含量顯著低于非礦山生態(tài)型，礦山生態(tài)型地上部生物量和磷積累量顯著高于非礦山生態(tài)型 (表1)，這可能是兩種生態(tài)型對土壤NaHCO3-Pi的獲取能力不同所致。

土壤NaOH-P屬中等活性磷組分，是植物可利用的潛在磷源。松樹根表5 mm范圍內(nèi)土壤NaOHP含量顯著降低[29]；不同基因型玉米根表3 mm內(nèi)NaOH-P含量明顯降低[30]；施氮也能影響土壤NaOH-P含量，F(xiàn)an等[31]向米櫧 (Castanopsis carlesii)天然林土壤中添加氮后，發(fā)現(xiàn)表層土壤NaOH-Pi和NaOHPo含量降低。本研究中，適宜施氮處理下兩種生態(tài)型根際微域土壤NaOH-Pi和NaOH-Po含量均在距根際6 mm微域內(nèi)顯著低于非根際土壤。可能是在高磷條件下適宜施氮時粗齒冷水花根際6 mm微域內(nèi)土壤受根系分泌物和根際微生物影響較大，磷的礦化分解程度旺盛，導致土壤NaOH-P向有效性更高的磷形態(tài)發(fā)生了轉(zhuǎn)化。與土壤中Ca或Mg氧化物結(jié)合的HCl-P較穩(wěn)定，有效性較差，Residual-P主要是硅酸鹽礦物磷和穩(wěn)定性較高的有機磷，難以被植物吸收利用[32]。野生大麥根際HCl-P含量低于非根際土壤，可能是根系分泌的質(zhì)子流出增加了土壤中與Ca或Mg氧化物結(jié)合磷的溶解度，從而降低了HCl-P含量[27,33]。然而本研究中兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤HCl-Pi和HCl-Po含量較穩(wěn)定，適宜施氮處理下無顯著變化，具體原因還有待進一步分析；而礦山生態(tài)型根際土壤Residual-P含量在適宜施氮處理下顯著低于非根際土壤，可能是在適宜施氮處理下其根際存在Residual-P向其它磷組分的轉(zhuǎn)化，導致其含量減少，表明礦山生態(tài)型在適宜施氮時對根際微域土壤磷的礦化能力較強。

3.2 適宜施氮對粗齒冷水花根際微域土壤磷酸酶活性的影響

土壤磷酸酶在調(diào)控土壤磷形態(tài)方面有著重要的作用，其活性的高低直接影響著土壤有機磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性[34–35]。土壤酶活性大小與土壤肥力密切相關(guān)，施肥增加土壤養(yǎng)分含量而導致土壤酶活性增強[36–38]。研究發(fā)現(xiàn)合理增施氮肥后，毛竹(Phyllostachys heterocycla)土壤酸性磷酸單酯酶活性增加[39]，老芒麥 (Elymus sibiricusL.)根際土壤堿性磷酸酶活性能提高57.30%[40]，另外氮磷同時添加會顯著提高華北落葉松人工林地土壤的土壤磷酸酶活性[41]，在高磷水平下油菜根際土壤酸性磷酸酶活性顯著高于低磷水平下[9]，本研究中，適宜施氮處理下兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際與非根際土壤酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性和植酸酶活性與不施氮相比均有所增加，可能是外源施氮可刺激微生物將過量的氮分配給磷酸酶，從而提高土壤磷酸酶活性[42]。松樹根表5 mm范圍內(nèi)酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性顯著高于非根際土壤[29]，油菜和大麥在根表3和4 mm范圍內(nèi)土壤酸性磷酸酶活性更高[9]。本研究中，兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和植酸酶活性分別在距根際4、2和8 mm微域內(nèi)顯著高于非根際土壤，可較好的解釋粗齒冷水花根際6 mm微域內(nèi)土壤NaHCO3-Po和NaOH-Po組分的減少 (圖3，圖4)。此外，結(jié)合表3可知，適宜施氮處理下，根際微域土壤H2O-P含量與3種酶活性均呈極顯著正相關(guān) (P<0.01)；NaHCO3-Pi含量與酸性磷酸酶和植酸酶活性呈極顯著或顯著正相關(guān)；NaHCO3-Po和NaOH-Po含量與磷酸酶活性均呈極顯著或顯著負相關(guān)。表明磷酸酶活性的升高和粗齒冷水花根際微域土壤有機磷的礦化過程具有密切的聯(lián)系，根際微域土壤磷酸酶活性的升高能促進有效性較高的磷組分增加。礦山生態(tài)型粗齒冷水花根際土壤有更高的磷酸酶活性，有利于根際土壤有機磷的礦化，可能是礦山生態(tài)型磷積累能力優(yōu)于非礦山生態(tài)型的原因之一。

表3 適宜施氮處理下粗齒冷水花根際微域土壤磷組分與酶活性的相關(guān)性Table 3 Correlation between phosphorus fractions and enzyme activities in rhizosphere soil of P.sinofasciata under suitable nitrogen application

4 結(jié)論

高磷條件下，適宜施氮可使有效性較高的H2O-P和NaHCO3-Pi在距兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際4和2 mm微域內(nèi)富集，同時可分解利用距根際6 mm微域內(nèi)的土壤NaHCO3-Po 和NaOH-P；適宜施氮量下，兩種生態(tài)型粗齒冷水花根際微域土壤酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和植酸酶活性分別在距根際4、2和8 mm微域內(nèi)顯著高于非根際土壤，更有利于根際土壤有機磷的礦化。與非礦山生態(tài)型相比，礦山生態(tài)型根際土壤磷酸酶活性更高，且對根際土壤中NaHCO3-Pi有更強的獲取能力，是其在適宜施氮處理下磷積累能力更強的重要原因。