鹽敏感型與耐鹽型高粱對鹽脅迫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組差異分析

范 娜，彭之東，白文斌

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高粱研究所 / 高粱遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新山西省重點(diǎn)實(shí)驗室，山西榆次 030600）

鹽脅迫是一類重要的非生物脅迫，嚴(yán)重制約了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。鹽脅迫條件下，土壤溶液滲透離子濃度增高，滲透勢發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜透性改變、影響植物根系對礦質(zhì)元素的吸收和植株形態(tài)的發(fā)育，抑制光合作用、呼吸作用以及物質(zhì)代謝等途徑[2]。鹽脅迫對作物的危害是一個復(fù)雜的生理過程，而作物抵抗鹽脅迫的能力主要由植物本身的遺傳基因控制，不同的作物對鹽脅迫的響應(yīng)方式也有所差異[3]。高粱作為一種重要的糧食兼經(jīng)濟(jì)作物，具有較強(qiáng)耐鹽能力。根據(jù)土壤鹽分變化規(guī)律可知，高粱苗期對鹽分脅迫最為敏感，苗期生長的好壞影響高粱的成熟度及產(chǎn)量[4]。目前國內(nèi)外對高粱耐鹽性的研究大都集中在形態(tài)和生理水平上，對高粱耐鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析、高粱耐鹽代謝途徑和關(guān)鍵耐鹽調(diào)控基因挖掘等方面研究較少[5–6]。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-seq)在農(nóng)作物抗逆性研究中應(yīng)用的越來越廣泛，對植物抗逆基因發(fā)掘和機(jī)制的研究具有重要意義。

本研究以高粱作為試材，結(jié)合苗期生長指標(biāo)的測定，對鹽脅迫處理表型差異較大的高粱材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行功能注釋，從轉(zhuǎn)錄組水平宏觀分析鹽脅迫下基因的表達(dá)特性，通過差異基因聚類分析、pathway分析和實(shí)時熒光定量RTPCR技術(shù)等，從分子水平研究植物鹽脅迫反應(yīng)的生理機(jī)制。發(fā)掘其中的關(guān)鍵調(diào)控基因，探求高粱在鹽脅迫下的耐受機(jī)制，旨在為高粱育種和耐鹽栽培提供一定的生理生化和分子理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及室內(nèi)耐鹽鑒定

前期采用室內(nèi)鹽分模擬和大田鑒定相結(jié)合的方法對600份高粱親本材料進(jìn)行篩選，通過測定發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、根長、葉長、葉片酶活性、葉片Na+和K+含量、幼苗生長指標(biāo)、大田農(nóng)藝指標(biāo)及產(chǎn)量指標(biāo)，篩選出耐鹽表型材料67B和鹽敏感表型材料3560R[7–8]，作為本次試驗的供試材料。

1.1.1 葉片酶活性測定 取鹽處理(150 mmol/L NaCl溶液處理) 12 h后的葉片材料，剪取擦拭干凈葉3～5片，3次重復(fù)，經(jīng)液氮處理放入超低濕冰箱中保存待測，利用南京建成試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)含量。

1.1.2 葉片 Na+、K+含量測定 取鹽處理 12 h 后葉片材料，采用火焰光度計法測定Na+、K+含量[7]。

1.1.3 幼苗生長指標(biāo)測定 用直尺測定植株根長、芽長，用電子天平稱量植株鮮重[8]。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

分別取鹽處理及對照組(加入等體積蒸餾水處理) 6、12 h葉片材料，前期試驗數(shù)據(jù)表明該時間點(diǎn)是高粱響應(yīng)鹽脅迫最敏感的時期。為了排除外在因素影響，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，設(shè)3次重復(fù)，并保證材料選取的平行性。對每個樣品分別進(jìn)行 RNA提取，用于后續(xù)試驗[9]。

1.2.1 總 RNA 的提取 采用 TIANGEN RNA plant plus Reagent試劑盒提取總RNA。利用1%瓊脂糖電泳、Nanodrop2000、Qubit 2.0 和 Aglient2100 方法檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性。

1.2.2 數(shù)字基因表達(dá)譜分析 (DGE)文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序，測序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析 cDNA文庫的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序樣品RNA由百邁客生物科技有限公司制備。RNA樣品通過質(zhì)量檢測進(jìn)入Illumina HiSeq 2000平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。測序得到的所有原始reads (raw data)經(jīng)過過濾得到純凈數(shù)據(jù) (clean data)，純凈數(shù)據(jù)再與指定參考基因組(Sbicolor_v2.1)比較得到比對數(shù)據(jù)(mapped data)。用HISAT2軟件將純凈數(shù)據(jù)與指定參考基因組進(jìn)行比對，再用StringTie軟件將比對上的reads進(jìn)行組裝，從而得到完整的比對數(shù)據(jù) (mapped data)。

1.2.3 差異表達(dá)基因篩選 將鹽脅迫處理的樣品測序得到的基因表達(dá)數(shù)據(jù)與對照處理的樣品測序得到的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，得到差異表達(dá)基因。該檢測過程中，采用Benjamini-Hochberg 的校正方法，篩選標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)≥2 且錯誤發(fā)現(xiàn)率 (false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.001。差異倍數(shù)(FC)=處理組某基因表達(dá)量/對照組該基因表達(dá)量。

1.2.4 差異基因的注釋和分類 將差異表達(dá)基因分別與 NR (NCBI non-redundant protein)、Swiss-Prot(Swiss-Prot proteinsequence)、KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)、COG (clusters of or thologousgroups of proteins)和 GO (gene ontology)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得與差異表達(dá)基因?qū)?yīng)的蛋白功能注釋信息。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR分析(qRT-PCR) 為了驗證高粱耐鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的準(zhǔn)確性，從差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)挑選5個基因，分析實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果是否與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽鑒定

表1為鹽脅迫處理15天后高粱幼苗生長狀況，耐鹽材料生長速率快，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性，而鹽敏感材料鹽脅迫下的根短、鮮重輕和生長速率低，對鹽脅迫較敏感。高粱苗期對鹽脅迫的響應(yīng)表現(xiàn)與后期高粱生長表現(xiàn)一致。

表1 高粱幼苗生長狀況Table 1 Growth indices of sorghum seedlings

鹽脅迫下導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中的Na+/K+增高，使液泡膜ATP酶和焦磷酸酶活性下降，從而抑制植物的正常生長，因此是否具有高Na+/K+是判斷植物耐鹽性的重要依據(jù)之一[10]。表2顯示，鹽脅迫條件下，耐鹽材料Na+含量小于鹽敏感材料，耐鹽材料可以提高Na+的選擇吸收及其在植株體內(nèi)的積累與分配；耐鹽材料和鹽敏感材料高粱葉片K+含量差異不顯著。

表2 鹽脅迫對高粱葉片K+、Na+濃度和K+/Na+值的影響Table 2 Effects of salt stress on K+ and Na+ concentration and K+/Na+ in sorghum leaves

植物處于鹽分逆境時，耐鹽材料比鹽敏感材料的SOD、CAT活性高，MDA含量低，說明植物對逆境抵抗能力的強(qiáng)弱與維持體內(nèi)較高抗氧化酶活性的能力強(qiáng)弱有關(guān)。表3顯示，耐鹽材料抗氧化酶活性都較強(qiáng)，清除活性氧、過氧化氫的能力較強(qiáng)。在鹽脅迫條件下，耐鹽材料可以維持較高的過氧化氫酶活性，受到鹽脅迫后該酶活性升高幅度相對較大，進(jìn)而保持了較強(qiáng)的過氧化氫清除能力，能夠及時清除過量積累的活性氧。

表3 鹽脅迫對高粱葉片SOD、CAT、MDA含量的影響Table 3 Effects of salt stress on the contents of SOD, CAT and MDA in sorghum leaves

2.2 高粱耐鹽轉(zhuǎn)錄組

2.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量可行性分析 鹽脅迫組與對照組所有樣本(共12個)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果經(jīng)過測序質(zhì)量控制篩選，共得到 90.07 Gb Clean Data，每個樣本測序所得的數(shù)據(jù)量均大于 6 G (6.1～8.2 G)，測序所得的clean reads數(shù)分別為21608762和30477544條，12個樣本的轉(zhuǎn)錄組序列GC (鳥嘌呤和胞嘧啶)含量介于55.19%到56.85%之間，略高于AT (腺嘌呤和胸腺嘧啶)含量，各樣品Q30堿基百分比均不小于94.40%。將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對，各樣本的reads比對效率在93.07%～95.11%。綜合以上幾個測序reads質(zhì)量評價指標(biāo)，說明這12份樣本的測序質(zhì)量較高，滿足DEG篩選及數(shù)據(jù)分析的要求。

2.2.2 與參考基因組比對結(jié)果統(tǒng)計 鹽脅迫下兩個品系共有5040個差異表達(dá)基因。對差異表達(dá)基因在所選參考基因組染色體不同位置上的reads的分布數(shù)量進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析比對到的序列在10條染色體上的分布情況。將比對到的不同染色體上的reads進(jìn)行位置分布統(tǒng)計，繪制比對到的序列(mapped reads)在所選參考基因組上的覆蓋深度分布圖(圖1)。

如圖1所示，測序結(jié)果在高粱的10條染色體上都有reads覆蓋，且覆蓋率差別不大，即在整個基因組中都有reads分布且分布均勻，其中覆蓋比例最高的是基因NC_012870.2，其次NC_012871.2和NC_012872.2(NC—耐鹽對照)。

圖1 Mapped reads在參考基因組上的位置及覆蓋深度分布圖Fig.1 Map of the location and depth of coverage of mapped reads on the reference genome

參考基因組的reads分為外顯子、內(nèi)含子和基因間區(qū)。理論上，比對到外顯子區(qū)的mRNA的reads其基因組注釋較為清晰，比對到內(nèi)含子是由于mRNA前體和發(fā)生可變剪切的內(nèi)含子保留，而比對到基因間區(qū)則表明基因組注釋不完善。如圖2所示，12個高粱樣本比對到reads在外顯子、內(nèi)含子與基因區(qū)間的比例分別為91.19%，3.92%，4.89%。

圖2 基因組reads在3個區(qū)域的分布比例Fig.2 Percentage of the genome reads in the three regions

12個高粱樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及比對拼接共得到31272個基因序列，其中在數(shù)據(jù)庫中有功能注釋的有29901個。這些基因在KEGG和KOG注釋比例僅為31.1%和49.7%，說明雖然高粱基因組已經(jīng)全測序完畢，但大部分基因的功能及參與調(diào)控途徑并未研究清楚，科研工作者們還有大量的研究工作要做。

2.2.3 差異表達(dá)基因分析 在相同鹽脅迫條件下，鹽敏感材料和耐鹽材料的差異表達(dá)基因數(shù)是不同的(圖3)。鹽敏感材料中共有2772個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因有1443個，下調(diào)基因有1329個。耐鹽材料中共有2268個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因有1217個，下調(diào)基因有1051個。鹽敏感材料的差異表達(dá)基因數(shù)目略多于耐鹽材料，兩品系中上調(diào)基因均略多于下調(diào)基因，差異表達(dá)基因的差異倍數(shù)主要集中在2～5倍。

圖3 鹽脅迫處理后高粱鹽敏感和耐鹽材料差異表達(dá)基因表達(dá)量變化Fig.3 Volcanic diagram of gene expression levels of salt-sensitive and salt-tolerant sorghum materials after salt stress

將耐鹽材料和鹽敏感材料的差異表達(dá)基因做韋恩圖分析，如圖4所示，鹽敏感材料和耐鹽材料差異表達(dá)基因有1009個是相同的，這些基因可能是高粱響應(yīng)鹽脅迫的共同表達(dá)基因，鹽敏感材料中有1763個基因特異表達(dá)，耐鹽材料中有1259個基因特異表達(dá)，這些特異表達(dá)的基因可能決定著兩個品系在同一鹽脅迫處理條件下的不同表型，說明鹽脅迫造成了兩個品系的基因表達(dá)變化。

圖4 兩個品系差異表達(dá)基因韋恩圖Fig.4 Venn diagram of differentially expressed genes in two sorghum materials

根據(jù)表4和圖5可知，N-1-1_N-1-2_N-1-3 (耐鹽材料處理 6 h) vs N-2-1_N-2-2_N-2-3 (耐鹽材料處理12 h)差異表達(dá)基因2268個，其中上調(diào)表達(dá)基因1217個(N-1-1表示耐鹽材料鹽脅迫處理|重復(fù)|，其他類推)；Y-1-1_Y-1-2_Y-1-3 (鹽敏感材料處理 6 h)vs Y-2-2_Y-2-1_Y-2-3 (鹽敏感材料處理 12 h)差異表達(dá)基因352個，其中上調(diào)表達(dá)基因178個(Y-1-1表示鹽敏感材料鹽脅迫處理|重復(fù)|，其他類推)；N-1-1_N-1-2_N-1-3 vs Y-1-1_Y-1-2_Y-1-3 差異表達(dá)基因1387個，其中上調(diào)表達(dá)基因612個；N-2-1_N-2-2_N-2-3 vs Y-2-1_Y-2-2_Y-2-3 差異表達(dá)基因 1241個，其中上調(diào)表達(dá)基因536個；Y-1-1_Y-1-2_Y-1-3 vs Y-2-1_Y-2-2_Y-2-3差異表達(dá)基因2772個，其中上調(diào)表達(dá)基因1443個。

圖5 兩個品系鹽脅迫12 h與鹽脅迫6 h相比差異表達(dá)基因的韋恩圖Fig.5 Venn diagram of differently expressed genes between salt stress of 12 h and 6 h of the two sorghum cultivars

表4 不同高粱材料鹽脅迫12 h與脅迫6 h相比差異表達(dá)基因的表達(dá)數(shù)Table 4 Number of differently expressed genes (DEGs) between sorghum cultivars at salt stress from 6 h to 12 h

耐鹽材料和鹽敏感材料中的差異表達(dá)基因，按照鹽脅迫后的變化幅度進(jìn)行聚類(圖6)。鹽敏感材料中的差異表達(dá)基因可分為4類：第一類為表達(dá)上調(diào)幅度較大的基因，共295個(占10.6%)，第二類為表達(dá)上調(diào)幅度較小的基因，共249個(占9.0%)，第三類為表達(dá)下調(diào)幅度較大的基因，共377個(占13.6%)，第四類為表達(dá)量雖有差異但變化幅度不大的基因，共1851個(占66.8%)。耐鹽材料中的差異表達(dá)基因可分為5類：第一類為表達(dá)下調(diào)幅度較小的基因，共53個(占2.3%)，第二類為表達(dá)下調(diào)幅度較大的基因，共283個(占12.5%)，第三類為表達(dá)上調(diào)幅度較大的基因共222個(占9.8%)，第四類為表達(dá)上調(diào)幅度較小的基因共51個(占2.2%)，第五類為表達(dá)變化幅度不大的基因共1659個(占73.1%)。表達(dá)上調(diào)幅度較小的基因比例鹽敏感材料中(9.0%)高于耐鹽材料中(2.2%)。

圖6 鹽脅迫處理下兩個品系差異表達(dá)基因的聚類分析Fig.6 Cluster analysis of differently expressed genes of the salt-tolerant and salt-sensitive cultivars after salt stress treatment

2.2.4 差異表達(dá)基因的GO分類與富集分析 GO數(shù)據(jù)庫是一個結(jié)構(gòu)化的標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)注釋系統(tǒng)，旨在建立基因及其產(chǎn)物知識的標(biāo)準(zhǔn)注釋體系。GO分析有助于我們理解基因的功能，GO條目即基因的注釋條目。

對鹽敏感材料和耐鹽材料的所有差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析(圖7)，覆蓋了絕大多數(shù)GO條目。鹽脅迫后，鹽敏感材料中的差異表達(dá)基因涉及了52個GO分類條目，其中與生物過程相關(guān)的有22個條目，上調(diào)表達(dá)基因522個，細(xì)胞過程上調(diào)表達(dá)基因430個，單組織過程上調(diào)表達(dá)基因343個；與分子功能相關(guān)的有15個條目，基因數(shù)目較多的是催化活性上調(diào)表達(dá)基因509個，及結(jié)合功能上調(diào)表達(dá)基因509個。

圖7 鹽敏感材料和耐鹽材料中差異表達(dá)基因GO分類Fig.7 GO classification of differently expressed genes in salt-sensitive and salt-tolerant materials

耐鹽材料在鹽脅迫處理后的差異表達(dá)基因涉及了三大一級條目中的52個二級GO分類條目，其中與生物過程相關(guān)的有22個條目，基因數(shù)目較多的是代謝過程上調(diào)表達(dá)基因494個，細(xì)胞過程上調(diào)表達(dá)基因373個，單組織過程上調(diào)表達(dá)基因330個；與分子功能相關(guān)的有13個條目，基因數(shù)目較多的是結(jié)合功能上調(diào)表達(dá)基因433個與催化活性上調(diào)表達(dá)基因475個。

2.2.5 差異表達(dá)基因的KEGG分類及Pathway顯著性富集分析 從鹽脅迫下鹽敏感材料的差異表達(dá)基因KEGG分類(圖8)可知，差異表達(dá)的基因分布在110條pathway中，其中差異基因數(shù)目最多的前5條pathway分別是植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(25條，6.53%)，碳代謝(24條，6.27%)，苯丙烷類合成(24條，6.27%)，淀粉與蔗糖代謝(23條，6.01%)及氨基酸生物合成(21條，5.48%)，這些pathway都與代謝通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

圖8 鹽敏感材料鹽脅迫下差異表達(dá)基因的KEGG分類Fig.8 KEGG classification of differently expressed genes in salt-sensitive materials under salt stress

由耐鹽材料的差異表達(dá)基因的KEGG分類(圖9)可知，差異表達(dá)的基因分布在104條pathway中，差異表達(dá)基因數(shù)目最多的前5條pathway分別是苯丙烷類合成(20條，6.73%)，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(16條，5.39%)，DNA復(fù)制(15條，5.05%)，植物病原菌互作(15條，5.05%)及碳代謝(13條，4.38%)，這些途徑與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和代謝通路有關(guān)。前5個pathways中，鹽敏感材料的差異表達(dá)基因在代謝通路中的占比高，而耐鹽材料的差異表達(dá)基因在傳導(dǎo)信號中的占比較高。

圖9 耐鹽材料鹽脅迫后的差異基因KEGG分類Fig.9 KEGG classification of differently expressed genes in salt-tolerant material after salt stress

對差異表達(dá)基因參與的pathway進(jìn)行富集分析。鹽敏感材料富集在前5位的pathway分別是硫辛酸代謝，二苯乙烯、雙苯庚烷與姜辣素合成，賴氨酸生物合成，有機(jī)含硒化合物代謝，DNA復(fù)制(圖10)。耐鹽材料富集在前5位的pathway分別是硫辛酸代謝、亞麻酸代謝、光合作用、硫胺代謝、DNA復(fù)制(圖11)。鹽敏感材料中差異表達(dá)基因主要集中在基礎(chǔ)代謝和次生物質(zhì) (basic metabolism and secondary substances)合成途徑，應(yīng)該是鹽脅迫引起了植株細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)的降解引起的，即主要是鹽脅迫傷害所致。耐鹽材料中差異表達(dá)基因參與的途徑除了次生產(chǎn)物合成途徑外，還包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和防御(signal transduction pathways and defense)途徑。

圖10 鹽敏感材料的差異表達(dá)基因KEGG富集圖Fig.10 KEGG enrichment of differently expressed genes in salt-sensitive material

圖11 耐鹽材料的差異表達(dá)基因KEGG富集圖Fig.11 KEGG enrichment diagram of differently expressed genes in salt-tolerant material

2.2.6 實(shí)時熒光定量PCR驗證 為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，從差異表達(dá)基因的數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)選取5個基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR驗證，以ACTIN-1為內(nèi)參，利用2–△△Ct計算各個樣品及各組中的基因相對表達(dá)量，5個基因的RPKM值(RPKM是 reads per kilobase per million mapped reads 的縮寫，代表每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù)。本試驗以5個基因?qū)φ盏腞PKM值作為基準(zhǔn)進(jìn)行比較，RPKM值與轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)差異均不顯著，且變化趨勢基本一致，表明9RT-PCR分析結(jié)果與測序結(jié)果吻合，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果準(zhǔn)確(圖12)。

圖12 目的基因各樣品中的相對表達(dá)量Fig.12 Relative expression of target gene in each sample

3 討論

轉(zhuǎn)錄組測序通過分析基因在鹽脅迫處理前后表達(dá)的模式，發(fā)掘與逆境相關(guān)的基因以及代謝通路，是研究植物鹽脅迫分子機(jī)制的重要手段[11]。

3.1 鹽脅迫對高粱幼苗生長的影響

室內(nèi)試驗表明，植物處于鹽分逆境時，耐鹽材料生長速率快，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性，Na+含量和Na+/K+明顯增加，而K+含量明顯下降。耐鹽材料Na+上升的幅度明顯小于鹽敏感材料，耐鹽材料SOD、CAT活性高，說明植物對逆境抵抗能力的強(qiáng)弱與維持體內(nèi)較高抗氧化酶活性的能力強(qiáng)弱有關(guān)。耐鹽材料抗氧化酶活性都較強(qiáng)，清除活性氧、過氧化氫的能力較強(qiáng)；在鹽脅迫條件下，耐鹽材料可以維持較高的過氧化氫酶活性，受到鹽脅迫后該酶活性升高幅度相對較大，進(jìn)而保持了較強(qiáng)的過氧化氫清除能力，能夠及時清除過量積累的活性氧，細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度較低。總之鹽脅迫下，耐鹽材料生長較好、生長速率快，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性；鹽敏感材料相對生長緩慢，耐鹽性弱，研究結(jié)果與董明等[5]、寶力格[12]研究一致。

3.2 差異表達(dá)基因表達(dá)水平聚類分析

轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是植物應(yīng)答逆境的關(guān)鍵步驟，鹽脅迫下同一物種不同品系耐鹽性不同其基因轉(zhuǎn)錄有不同的應(yīng)答模式[12]。本試驗表明，鹽脅迫處理后，兩品系材料的差異表達(dá)上調(diào)基因數(shù)量略多于下調(diào)基因數(shù)量，但是鹽敏感材料的差異表達(dá)基因數(shù)目略多于耐鹽材料。

將鹽敏感材料中的2772個差異表達(dá)基因和耐鹽材料中的2268個差異表達(dá)基因做層次聚類分析，鹽敏感材料中的差異表達(dá)基因按照表達(dá)模式的不同可分為4類，耐鹽材料中的差異表達(dá)基因按照表達(dá)模式的不同可分為5類。

3.3 差異表達(dá)基因分析

GO富集分析顯示激素響應(yīng)、光合作用以及碳代謝相關(guān)途徑，旨在建立基因及其產(chǎn)物知識的標(biāo)準(zhǔn)注釋體系。GO分析有助于我們理解基因的功能，GO條目即基因的注釋條目[13]。KEGG分析還發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因涉及激素信號傳導(dǎo)、光合作用以及類黃酮代謝途徑，這些代謝途徑在應(yīng)對鹽脅迫過程中起著重要作用。

本研究表明，鹽敏感材料和耐鹽材料的差異表達(dá)基因GO分類在各注釋條目上的分布趨勢大致相同，各條目上的差異表達(dá)基因數(shù)目相差不大，富集情況基本一致，說明鹽敏感材料和耐鹽材料對鹽脅迫的響應(yīng)途徑是相同的。鹽敏感材料中各條目上的上調(diào)表達(dá)基因數(shù)略多于下調(diào)表達(dá)基因數(shù)，而耐鹽材料中各條目上的上調(diào)表達(dá)基因數(shù)目顯著多于下調(diào)表達(dá)基因數(shù)目，說明耐鹽材料是通過增加上調(diào)表達(dá)基因的數(shù)量來抵抗逆境的。在鹽脅迫中起主要作用的是調(diào)控結(jié)合功能和催化活性的基因，參與的主要生物過程有細(xì)胞過程、單組織過程和代謝過程，這與董明等[5]的研究結(jié)果一致。

鹽敏感材料和耐鹽材料的差異表達(dá)基因在KEGG各pathway中的分布趨勢差別很大，差異表達(dá)基因數(shù)排名前5的條目有3條相同，兩條不同。鹽敏感材料中兩條不同的條目分別是淀粉與蔗糖代謝及氨基酸生物合成，與基礎(chǔ)代謝有關(guān)。耐鹽材料中兩條不同的條目分別是植物病菌互作和DNA修復(fù)，推測與其耐鹽性有關(guān)。鹽脅迫下，耐鹽材料和鹽敏感材料代謝通路有所不同。本研究結(jié)果與張飛等人的研究結(jié)果[14–16]相符，耐鹽和鹽敏感材料在對照和鹽漬脅迫條件下在苯丙烷類生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成3個途徑中差異表達(dá)基因較多，可能是造成兩個材料耐鹽性差異的重要原因。

4 結(jié)論

高粱鹽敏感材料和耐鹽材料耐鹽基因表達(dá)差異顯著。耐鹽材料調(diào)控基因涉及植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳代謝、苯丙烷類合成、淀粉與蔗糖代謝及氨基酸生物合成。鹽敏感材料上調(diào)表達(dá)基因包括：細(xì)胞過程上調(diào)表達(dá)基因430個，單組織過程上調(diào)表達(dá)基因343個，催化活性上調(diào)表達(dá)基因509個，結(jié)合功能上調(diào)表達(dá)基因509個；耐鹽材料上調(diào)表達(dá)基因包括：代謝過程上調(diào)表達(dá)基因494個，細(xì)胞過程上調(diào)表達(dá)基因373個，單組織過程上調(diào)表達(dá)基因330個，結(jié)合功能上調(diào)表達(dá)基因433個，催化活性上調(diào)表達(dá)基因475個。