宮頸病變組織中高危型乳頭瘤病毒感染及SLC5A8、RASSF2A基因啟動子甲基化陽性率

況 漫 朱貴娟 馬亞琳

湖北省十堰市人民醫院(442000)

宮頸上皮內病變是宮頸浸潤癌前病變，與其發生發展密切相關[1]。宮頸病變發展至宮頸癌前及時發現并給予有效干預具有重要意義[2-3]。人乳頭瘤病毒(HPV)可引發不同性質的腫瘤[4]。SLC5A8基因是2002年被發現，近些年研究認為其表達在腫瘤發生中意義重要[5]。RASSF2A基因是RAS相關結構域家族基因2的A轉錄本，是潛在腫瘤抑制基因，與多種腫瘤的發生有密切關系[6]。本研究對宮頸病患者臨床資料進行分析，探究高危型HPV感染及SLC5A8、RASSF2A基因啟動子甲基化在宮頸病變診斷中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2018年5月-2021年5月本院收治的宮頸病變患者186例臨床資料，年齡(48.0±5.3)歲(26～61歲)。納入標準：①符合《宮頸病變的診斷與治療》[7]中宮頸病變診斷標準；②初次接受治療；③未合并其他惡性腫瘤。排除標準：①已接收放射或化療藥物治療；②妊娠期；③資料不完整。根據陰道鏡宮頸活檢病理診斷結果，分為宮頸上皮內瘤變I級組(73例)、II級組(57例)、III級組(56例)，正常細胞為對照組(43例)。本研究經院倫理委員會審批。

1.2 宮頸細胞檢測

1.2.1HBVDNA采用北京英碩力金柏科技有限公司的HBV DNA檢測試劑盒，PCR擴增法檢測。先將89μl擴增混合液與1μlTAQ酶配置PCR反應體系(100μl)。按照標記向每個PCR管內加入10μl對應的樣本DNA或陽性對照控品。混勻，離心后收集。將已配備完成的PCR擴增體系加入適宜的PCR擴增儀內：50℃ 2min，64℃ 4min，94℃ 30s；48℃ 45s，72℃ 20s，重復28個周期；隨后94℃ 30s，65℃ 45s，72℃ 20s，重復25個周期。隨后4℃下完成反應。將擴增產物處理后在儀器檢測，探針信號值≥40m陽性，<40m陰性。

1.2.2SLC5A8基因啟動子采用上海英濰捷貿易有限公司的SLC5A8檢測試劑盒，甲基化特異性PCR法檢測。按照說明書提取樣本DNA并修飾，SLC5A8甲基化上游引物為5'-TCGAACGTATTTCGAGGC-3'，下游引物為5'-ACAACGAATCGATTTTCCG-3'；將對應的引物進行亞硫酸氫鹽修飾DNA樣本擴增：PCR在50℃ 2min，95℃ 2min；95℃ 15s；60℃ 30s，循環40次，對反應產物開始凝脂糖凝膠電泳。

1.2.3RASSF2A基因啟動子甲基化采用北京天根生化科技公司試劑盒，按照DNA提取試劑盒說明書提取檢測。收集1μgDNA溶于50μl水內，加入3mol/LNAOH溶液3.3μl，37℃下孵育15min；加入10mmolL氫醌 30μl以及520μl的亞硫酸氫鈉混勻，50℃水浴16h。經過堿基修飾后的DNA進行脫鹽、純化和回收。修飾后DNA開始聚合酶鏈反應，甲基特異性引物：5'-GTTCGTCGTCGTTTTTTAGGCG-3'以及5'-AAAAACCAACGAC-CCCCGCG-3'，擴增的片段為108bp，反應體積30μl，在95℃下預變性5min，在95℃下變性30s，58℃退火30℃，72℃延伸30s。連續35個周期，在72℃下再次延伸6min，PCR產物通過瓊脂糖電泳，在溴化乙錠染色后在凝膠成像系統下觀察。

1.3 觀察指標

檢測各組標本HPV DNA、SLC5A8以及RASSF2A基因啟動子甲基化陽性率。

1.4 方法

2 結果

2.1 各組標本HPV DNA陽性率對比

HPV DNA陽性率，對照組(0,0/43)、宮頸上皮內瘤變Ⅰ級組(28.8%,21/73)、Ⅱ級組(63.2%,36/57)、Ⅲ級組(92.9%,52/56)依次升高(χ2=54.358，P<0.001)。

2.2 各組標本SLC5A8基因啟動子甲基化陽性率對比

對照組、Ⅰ級組、Ⅱ級組、Ⅲ級組標本SLC5A8基因啟動子甲基化及RASSF2A基因啟動子甲基化陽性率均依次升高(均P<0.05)。見表1。

表1 各組基因啟動子甲基化陽性率對比[例(%)]

3 討論

宮頸病變為多重原因造成的宮頸部位發生病理性變化，包括感染、病原體入侵等引起的宮頸炎、宮頸腫瘤等[7-8]。導致宮頸病變的因素多種，病情程度可分為輕、中、重度，治療不及時可能發展為宮頸癌，所以宮頸病變早期篩查與診斷極為重要[9-10]。

HPV是導致宮頸病變的危險因素，高危型HPV感染與宮頸癌的發生關系密切[11]。本研究結果顯示，與對照組相比，子宮上皮內瘤病變I級、II級、III級組標本HPV DNA陽性率逐漸升高。SLC5A8基因是一種腫瘤抑制基因，該基因編碼蛋白是一種細胞運載體，對乳酸、煙酸以及脂肪酸等進行轉運，同時能對碘化物進行轉運[12]。SLC5A8基因能夠把丁酸運轉到細胞內，且能發揮組蛋白脫乙酰基酶抑制劑的功能，在上皮細胞癌前病變中發揮重要作用，可促進腫瘤細胞的凋亡[13]。本研究結果顯示，對照組、子宮上皮內瘤病變I級、II級、III級組標本SLC5A8基因啟動子甲基化陽性率逐漸升高，說明SLC5A8基因啟動子甲基化與宮頸病變發生發展有一定關系。RASSF2A基因在人體腦、胎盤以及血液中較高表達，含有多種轉錄本，同時啟動子區域含有多種CpG島，能夠促進轉錄的甲基化[14-15]。本研究結果顯示，對照組、子宮上皮內瘤病變I級、II級、III級組標本SLC5A8基因啟動子甲基化陽性率逐漸升高。可能因為：RASSF2A基因可以激活caspase3引起細胞的凋亡，且能導致細胞周期阻滯在G1期，抑制上皮細胞瘤的增生[16]。

本次研究通過檢測不同病變程度患者標本中高危型HPV感染及SLC5A8、RASSF2A基因啟動子甲基化陽性表達率存在差異，提示上述檢測指標在宮頸病變中可能發揮重要作用，為臨床防治提供思路。