子癇前期患者外周血及胎盤組織中Amphiregulin表達(dá)水平及與妊娠結(jié)局關(guān)系

劉紅梅 劉曉玲 潘明霞 鐘 麗

青島婦女兒童醫(yī)院(266000)

子癇前期是妊娠期高血壓疾病的一種形式[1]，影響3%～7%的妊娠結(jié)局，可導(dǎo)致母嬰死亡[2]。其確切病因尚不明確，遺傳易感性、炎癥反應(yīng)、胎盤缺血缺氧以及血管內(nèi)皮損傷已被報(bào)告為相關(guān)因素[3]。表皮生長因子(EGF)是參與正常細(xì)胞生長和分化的促有絲分裂蛋白，表皮雙調(diào)蛋白(Amphiregulin)結(jié)合EGF樣生長因子，是EGF配體[4]。Amphiregulin是胎盤、卵巢、睪丸、心臟、胰腺、脾臟、骨髓、血液、腎、肺、結(jié)腸和乳腺等眾多器官和組織中分泌的EGF配體[5]。Amphiregulin通過結(jié)合EGFR激活多種信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與細(xì)胞存活、增殖等生理過程[6]。據(jù)報(bào)道，在炎癥和腫瘤條件下Amphiregulin表達(dá)量減少[7]。目前，尚未見Amphiregulin在子癇前期中的相關(guān)研究報(bào)道，因此本研究探討子癇前期患者外周血和胎盤組織中Amphiregulin表達(dá)水平及與妊娠結(jié)局的關(guān)系，為子癇前期的診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年6月-2020年9月本院收治的子癇前期孕婦203例，根據(jù)病情分為子癇前期輕度102例、重度101例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②單胎妊娠，剖宮產(chǎn)分娩；③患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①內(nèi)分泌疾??；②年齡18～45歲；③原發(fā)性高血壓。同期產(chǎn)前檢查健康孕婦108例為對(duì)照組。子癇前期重度診斷標(biāo)準(zhǔn)：在沒有蛋白尿情況下，存在以下任何一種情況，即重度高血壓(未服用降壓藥情況下休息后，收縮壓160mmHg或舒張壓≥110mmHg)、血小板減少癥(血小板計(jì)數(shù)<100000/ml)、肝功能受損(肝轉(zhuǎn)氨酶增加兩倍)、腎功能不全(血清肌酐升高>1.1mg/dl或加倍在沒有其他腎臟疾病的情況下血清肌酐升高)、肺水腫、新發(fā)腦或視力障礙。本研究遵循赫爾辛基宣言的原則，獲得機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，參與者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1胎盤收集剖宮產(chǎn)中獲取胎盤，除去胎盤厚度的立方體部分(3.0cm×3.0cm)，收集從基底到胎盤內(nèi)部區(qū)域的絨毛膜表面,磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌去除表面血液，將樣品在液氮中速凍，-80°C保存。

1.2.2AmphiregulinmRNA檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄法(RT-PCR)。使用 UNlQ-10 Column TRIzol總RNA分離試劑盒(Sangon Biotech Co.Ltd.)分離胎盤、血清組織總RNA，使用 PrimeScriptTMRT 試劑盒(Takara Bio, Inc)逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。使用條件：30s 95℃，5 s 95℃、34 s 60℃、15 s 95℃和1min 50℃的50個(gè)循環(huán)。Amphiregulin基因特異性引物從PrimerBank獲得，引物序列：Amphiregulin正向，5'-TCGATCGATCGATCGATCGGGGCTAG CTAGCTAGCTAGCTA GTCG-3'和反向，5'-TGGCGATCGATCGATCGATCGATCGTAGCTAG CTAGCTAGCTAGCC-3'。β-actin為內(nèi)參基因，引物序列為正向，5'-TCGGGCCTAGCTAGCT AGCTAGCTAGGGCTAGCTAGCTGATCGTGT GC-3'，反向，5'-TGGTCGATCGATCGATGCTAGCTAGTCGATCGATCGTAGCTAGCTA GTCGATCG-3'，使用2-ΔΔCq方法計(jì)算差異表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.3Amphiregulin蛋白水平酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定(ELISA)。Amphiregulin(Shanghai Sunred Biological Technology)。在MK-3 Multiskan FC酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)450nm波長下測(cè)定樣品吸光度(ng/ml)。Amphiregulin試劑盒測(cè)定內(nèi)方差系數(shù)(CV)、測(cè)定間CV、檢測(cè)范圍和靈敏度分別報(bào)告為<10%、<12%和0.08～24ng/ml和0.076ng/ml。

1.2.4Amphiregulin蛋白免疫組化測(cè)定在4μm厚的石蠟包埋的前列腺組織切片上進(jìn)行Amphiregulin(1:200，610153，BD Biosciences，San Jose，CA，USA)蛋白免疫組化測(cè)定。組織切片均行微波抗原修復(fù)預(yù)處理，使用Dako REALTMEnVision試劑盒(Dako, Carpinteria, CA, USA)檢測(cè)。3-氨基-9-乙基咔唑(Immunotech，F(xiàn)oster City，CA，USA)用作色原并用Mayer's蘇木精(Dako)復(fù)染。陰性對(duì)照染色在不應(yīng)用一抗的情況下進(jìn)行。Amphiregulin核表達(dá)通過評(píng)估染色強(qiáng)度≥10%的細(xì)胞中陽性情況下評(píng)分：0，無染色或≤10%陽性；1，弱染色；2，中度染色；3，染色性強(qiáng)，1～3為陽性表達(dá)。

1.3 妊娠結(jié)局評(píng)估

記錄子癇前期患者產(chǎn)后結(jié)局，包括胎盤重量、新生兒出生體重及1min Apgar評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較

表1可見，病例組舒張壓和收縮壓均高于對(duì)照組(P<0.05)，兩組年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)等無差異(P>0.05)。

表1 兩組一般情況比較

2.2 各組血清、胎盤Amphiregulin表達(dá)比較

血清及胎盤Amphiregulin mRNA、Amphiregulin 蛋白表達(dá)水平子癇前期重度組、子癇前期輕度組、對(duì)照組均依次升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組不同標(biāo)本中Amphiregulin表達(dá)比較

2.3 Amphiregulin免疫組化陽性率比較

Amphiregulin主要定于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或深棕黃色顆粒，Amphiregulin陽性為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒；Amphiregulin陽性率子癇前期重度組、子癇前期輕度組、對(duì)照組逐漸升高(P<0.05)。見表3、圖1(1938頁)。

表3 各組Amphiregulin免疫組化陽性率比較[例(%)]

2.4 子癇前期嚴(yán)重程度與Amphiregulin表達(dá)相關(guān)性

子癇前期嚴(yán)重程度與胎盤及血清Amphiregulin mRNA、蛋白表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.674、-0.601、-0.596、-0.587，P=0.001、0.015、0.004、0.009)。

2.5 各組孕產(chǎn)婦妊娠結(jié)局比較

胎盤重量、新生兒出生體重、1min Apgar評(píng)分在子癇前期重度組、子癇前期輕度組、對(duì)照組依次升高(均P<0.05)。見表4。

表4 各組妊娠結(jié)局比較

2.6 孕產(chǎn)婦Amphiregulin與妊娠結(jié)局相關(guān)性

表5可見，血清、胎盤Amphiregulin mRNA及蛋白與胎盤重量、新生兒出生體重、1min Apgar評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)。

表5 孕產(chǎn)婦Amphiregulin表達(dá)水平與妊娠結(jié)局相關(guān)性

3 討論

研究表明Amphiregulin相關(guān)基因和蛋白質(zhì)在癌癥和心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。該途徑的核心是在腫瘤抑制因子處啟動(dòng)的激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)Hippo對(duì)其下游效應(yīng)器，即癌蛋白Amphiregulin/TAZ。與非妊娠子宮內(nèi)膜的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(ESC)相比，妊娠蛻膜細(xì)胞中Amphiregulin的表達(dá)更高。低Amphiregulin水平通過調(diào)節(jié)CDX2來調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和凋亡，從而促進(jìn)子癇前期的發(fā)展[9]。因此Amphiregulin可能在子癇前期的病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用。

研究表明，Amphiregulin在人類妊娠期間由合體滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)，并刺激人絨毛膜促性腺激素分泌。在嗜鉻細(xì)胞瘤、產(chǎn)生皮質(zhì)醇的腎上腺皮質(zhì)腺瘤、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤的腫瘤組織中均有Amphiregulin mRNA表達(dá)。Amphiregulin對(duì)腎上腺分泌醛固酮、皮質(zhì)醇和兒茶酚胺有刺激作用，導(dǎo)致血壓升高[10]；Amphiregulin通過與EGFR結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長；通過自分泌或旁分泌途徑激活細(xì)胞存活的信號(hào)級(jí)聯(lián)導(dǎo)致子癇前期中胎盤床和絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡增加[11]；Amphiregulin通過激活EGF/EGFR/SOS1通路抑制p53凋亡刺激蛋白，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的凋亡抵抗[12-13]。因此，Amphiregulin水平降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，由于滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和存活的減少以及細(xì)胞凋亡的增加，Amphiregulin的減少可能在子癇前期的發(fā)病機(jī)制中起作用[13-14]。EGF-Amphiregulin復(fù)合物可能具有雙重作用，即早期滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和晚期滋養(yǎng)細(xì)胞分化，從而有助于控制胎盤生長[15]。國外研究報(bào)道與非子癇前期患者相比，子癇前期患者的血漿Amphiregulin水平降低，子癇前期妊娠胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中EGF-Amphiregulin信號(hào)系統(tǒng)的廣泛下調(diào)，提出假設(shè)，即子癇前期中EGF-Amphiregulin信號(hào)系統(tǒng)的缺陷導(dǎo)致絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞分化不當(dāng)和細(xì)胞凋亡增加[16-17]。與該研究類似，本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，子癇前期患者的血清及胎盤Amphiregulin mRNA和蛋白表達(dá)均降低，且隨著子癇前期嚴(yán)重程度增加表達(dá)降低，子癇前期嚴(yán)重程度與胎盤及血清Amphiregulin mRNA和蛋白表達(dá)均負(fù)相關(guān)，說明子癇前期患者外周血和胎盤組織中Amphiregulin表達(dá)異常降低，且與子癇前期病情發(fā)展有關(guān)。

本研究分析了Amphiregulin表達(dá)水平與妊娠結(jié)局相關(guān)性，結(jié)果顯示血清及胎盤Amphiregulin mRNA和蛋白表達(dá)水平均與胎盤重量、新生兒出生體和1min Apgar評(píng)分呈正相關(guān)。近期一項(xiàng)國外研究表明，Amphiregulin水平臨界值3590pg/ml時(shí)，診斷重度先兆子癇的敏感性為67.9%、特異性為63.3%[18]。結(jié)合本研究中Amphiregulin表達(dá)與妊娠結(jié)局相關(guān)性明顯，提示臨床Amphiregulin可作為評(píng)估子癇前期患者妊娠不良結(jié)局的敏感生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，子癇前期患者外周血和胎盤組織中Amphiregulin表達(dá)水平異常降低，且與子癇前期嚴(yán)重程度相關(guān)；Amphiregulin表達(dá)水平與妊娠結(jié)局相關(guān)性明顯，提示Amphiregulin可作為評(píng)估子癇前期患者妊娠不良結(jié)局的生物學(xué)標(biāo)志物。