外周血自噬基因Benlin-1表達聯合APACHEⅡ評分預測膿毒癥患者28 d病死的研究

王 佳，高恒波，林雪容，羅肖宇，陳麗君，韓樹池

(1. 河北北方學院附屬第一醫院急診科，河北 張家口075000；2. 河北醫科大學第二醫院急診科，河北 石家莊050000)

急性生理和慢性健康評分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ)是評價膿毒癥預后的常用指標[1-3]。新近的研究認為免疫功能抑制、自噬、內質網應激、凋亡等環節與膿毒癥的發生發展密切相關[4-6]。淋巴細胞是重要的免疫細胞，有動物實驗報道，激活自噬能夠促進膿毒癥小鼠體內CD4+T淋巴細胞的存活[7]；另有臨床研究證實，膿毒癥患者外周血淋巴細胞中自噬基因Beclin-1的表達明顯減少且與病情加重、預后惡化有關[8-9]，提示淋巴細胞自噬減弱是影響膿毒癥預后的可能因素。本研究旨在探索Beclin-1聯合APACHEⅡ評分預測膿毒癥患者28 d病死的價值。旨在為臨床評價膿毒癥的病情及預后提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月—2019年10月期間河北北方學院附屬第一醫院收治的膿毒癥患者238例作為膿毒癥組，入組標準：①符合《中國膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)》[10]中膿毒癥的診斷標準；②入院后即刻留取外周靜脈血標本；③臨床資料完整。排除標準：①合并惡性腫瘤、血液系統疾病、免疫功能缺陷疾病；②入院前正在使用免疫抑制劑或糖皮質激素治療；③妊娠及哺乳。另取同期體檢健康者104例作為對照組。膿毒癥組中男性131例、女性107例，年齡45～72歲、平均(56.38±8.85)歲；對照組中男性59例、女性45例，年齡40～68歲、平均(55.29±8.45)歲。2組一般資料比較差異有統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究取得醫院倫理委員會批準。

1.2試劑與儀器 淋巴細胞分離液、RIPA裂解液、BCA試劑盒均為上海碧云天公司，Beclin-1一抗為美國Abcam公司，β-actin一抗為美國Sigma公司，電泳系統及凝膠成像系統為上海天能公司。

1.3方法

1.3.1外周血Beclin-1表達的檢測 取膿毒癥組和對照組的外周靜脈血5 mL，采用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，而后加入RIPA裂解液裂解淋巴細胞、提取蛋白，采用BCA試劑盒檢測蛋白含量，將含有30 μg蛋白的樣本用于Western blot實驗。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離蛋白，電轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫孵育PVDF膜1 h，1∶1 000稀釋的Beclin-1一抗或1∶2 500稀釋的β-actin一抗4℃孵育PVDF膜過夜，洗膜3次后室溫孵育1∶2 000稀釋的二抗1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到蛋白條帶，根據條帶灰度值、以β-actin為內參計算Beclin-1的表達水平。

1.3.2收集臨床資料 查閱膿毒癥患者的病歷，收集以下臨床資料：性別，年齡，既往病史(高血壓、糖尿病)，生命體征(體溫、收縮壓、舒張壓)，入科24 h的實驗室檢查指標[白細胞計數(white blood cell，WBC)、血紅蛋白(hemoglobin，Hb)、血小板計數(platelet count，PLT)、白蛋白(albumin，ALB)、丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、肌酐(creatinine，Cr)、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)，根據入院后24 h內各項指標的最差值計算APACHEⅡ]。

1.3.3預后情況判斷 查閱膿毒癥患者的病歷，根據入科后28 d的病情判斷預后，包括存活和死亡，自動出院或臨終前放棄的患者均視作死亡。

1.4統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用t檢驗、秩和檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗；預后的比較采用Kaplan-Meier曲線分析及ROC曲線分析，預后的影響因素采用COX模型分析，聯合指標的生成采用Logistic回歸模型分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1膿毒癥組與對照組外周血Beclin-1表達的比較 與對照組比較，膿毒癥患者外周血中Beclin-1的表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 膿毒癥組與對照組外周血Beclin-1表達的蛋白電泳圖

表1 膿毒癥組與對照組外周血Beclin-1表達的比較Table 1 Comparison of beclin-1 expression in peripheral blood between sepsis group and control group

2.2外周血Beclin-1預測膿毒癥患者28 d病死的Kaplan-Meier曲線及ROC曲線分析 按照膿毒癥組患者外周血Beclin-1表達的中位數將其分為高表達患者和低表達患者，經Kaplan-Meier曲線分析，與Beclin-1高表達患者比較，低表達患者的28 d累積病死率明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。繪制外周血Beclin-1表達預測膿毒癥患者28 d病死的ROC曲線，曲線下面積為0.5947(95%CI：0.5210～0.6683，P=0.015)。見圖2。

圖2 外周血Beclin-1預測膿毒癥患者28 d病死的Kaplan-Meier曲線及ROC曲線A.外周血Beclin-1預測膿毒癥患者28 d病死的Kaplan-Meier曲線;B.外周血Beclin-1預測膿毒癥患者28 d病死的ROC曲線Figure 2 Kaplan-Meier curve and ROC curve of Beclin-1 in peripheral blood in predicting 28-day mortality in patients with sepsis圖3 APACHEⅡ評分預測膿毒癥患者28 d病死的Kaplan-Meier曲線及ROC曲線A.APACHEⅡ評分預測膿毒癥患者28 d病死的Kaplan-Meier曲線;B.A-PACHEⅡ評分預測膿毒癥患者28 d病死的ROC曲線

2.3APACHEⅡ評分預測膿毒癥患者28 d病死的Kaplan-Meier曲線及ROC曲線分析 按照膿毒癥組患者APACHEⅡ評分分為<15分患者、15～25分患者、>25分患者，經Kaplan-Meier曲線分析，與APACHEⅡ評分分為<15分及15～25分患者比較，APACHEⅡ評分>25分患者的28 d累積病死率明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。繪制APACHEⅡ評分預測膿毒癥患者28 d病死的ROC曲線，曲線下面積為0.5861(95%CI：0.511～0.661，P=0.027)。

2.4膿毒癥組中存活患者與病死患者臨床資料的比較 與膿毒癥中存活患者比較，病死患者的性別、年齡、高血壓、糖尿病、體溫、舒張壓、WBC、Hb、PLT、ALB、ALT、AST、CRP差異無統計學意義(P>0.05)， Cr、PCT、APACHEⅡ評分明顯增加，收縮壓、Beclin-1表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 膿毒癥組中存活患者與死亡患者臨床資料的比較Table 2 Comparison of clinical data between survival patients and dead patients in sepsis group

2.5膿毒癥患者28 d病死影響因素的COX回歸分析 以膿毒癥組患者預后作為應變量(存活=0、病死=1)，以Beclin-1、APACHEⅡ、收縮壓、Cr、PCT作為連續自變量，進行COX回歸分析可知Beclin-1、APACHEⅡ評分是膿毒癥組患者預后的影響因素，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 膿毒癥患者28 d病死影響因素的COX回歸分析Table 3 COX regression analysis of influencing factors of 28-day mortality of sepsis patients

2.6外周血Beclin-1與APACHEⅡ評分聯合指標預測膿毒癥患者28 d病死的Logistic回歸與ROC曲線聯合分析 在Logistic回歸模型中生成Beclin-1聯合APACHEⅡ評分預測膿毒癥組患者預后的新指標方程為：-0.566-2.238×Beclin-1+0.065×APACHEⅡ評分。該聯合指標預測膿毒癥患者28 d病死的ROC曲線下面積為0.6452(95%CI：0.5694～0.7211，P<0.001)。見圖4。

圖4 外周血Beclin-1與APACHEⅡ評分聯合指標預測膿毒癥患者28 d病死的ROC曲線

3 討 論

膿毒癥是重癥醫學領域的研究熱點，救治難度大、預后差、病死率高，學者們不僅致力于研究膿毒癥發病的病理生理機制，同時也在探索能夠準確評估病情及預后的監測指標和方法。APACHEⅡ評分是目前重癥醫學科應用最廣泛的病情評價指標，國內外多項研究已經證實APACHEⅡ評分是膿毒癥患者預后的影響因素[10]。雖然APACHEⅡ評分系統涵蓋了慢性病、缺氧、炎癥、休克等與膿毒癥病情相關的因素，但卻未能納入近些年發現與膿毒癥發病相關的自噬、內質網應激、凋亡等環節。因此，本研究從新發現的膿毒癥病理生理機制切入，尋找新的標志物與APACHEⅡ評分聯合評價膿毒癥預后，旨在為提高評估膿毒癥預后的準確性提供參考。自噬是近些年受到越來越多關注的膿毒癥相關病理生理機制[11-13]。自噬是溶酶體降解蛋白質、細胞器并進行再利用的過程，適度的自噬有利于維持細胞穩態，使細胞在感染、應激等病理因素作用下存活。在膿毒癥的發病過程中存在免疫功能抑制，多項臨床研究證實膿毒癥患者外周血淋巴細胞減少且淋巴細胞的自噬減弱[8-9]；另有動物實驗研究顯示激活自噬能夠促進膿毒癥小鼠體內淋巴細胞存活[14]，Ying等[15]的研究顯示抑制自噬能夠促進膿毒癥小鼠體內淋巴細胞凋亡。本研究通過檢測外周血淋巴細胞中自噬基因Beclin-1的表達來評價淋巴細胞的自噬程度，與對照組比較，膿毒癥組外周血中Beclin-1的表達明顯減少，與國內的研究結果一致[8-9]，表明膿毒癥發病過程中淋巴細胞的自噬受到抑制。

隨著膿毒癥病情的加重，預后也相應變差、病死率相應升高。研究證實，膿毒癥死亡患者外周血中Beclin-1的表達水平低于存活患者[8]；結合已有基礎研究證實自噬對淋巴細胞的保護作用進行分析，膿毒癥發病過程中淋巴細胞自噬減弱不利于細胞存活、造成淋巴細胞減少及免疫功能抑制，進而導致膿毒癥病情加重、病死率增加。本研究進一步采用Kaplan-Meier曲線及ROC曲線分析了Beclin-1表達與膿毒癥預后的關系，結果顯示與Beclin-1高表達患者比較，低表達患者的28 d累積病死率明顯增加且Beclin-1表達對膿毒癥患者28 d病死具有預測價值。此結果與Beclin-1介導自噬對淋巴細胞的保護作用吻合，表明Beclin-1表達減少與膿毒癥病死率增加有關。

膿毒癥預后的影響因素復雜，其中APACHEⅡ評分是目前公認的膿毒癥預后影響因素[1-3,16]，本研究中Kaplan-Meier曲線及ROC曲線分析也驗證了APACHEⅡ評分對膿毒癥患者預后的評估價值。但使用單一指標對預后進行評價仍有一定的局限性，本研究將采用Beclin-1聯合APACHEⅡ評分的方式對膿毒癥的預后進行評價。經COX回歸分析，Beclin-1及APACHEⅡ評分是膿毒癥預后的影響因素，在此基礎上通過Logistic回歸產生Beclin-1聯合APACHEⅡ評分的方程、以此作為評價預后的新指標，該新指標對膿毒癥患者28 d病死具有預測價值，且預測的ROC曲線下面積優于單一指標。

綜上所述，膿毒癥患者外周血自噬基因Beclin-1表達減少且與28 d病死率增加有關，Beclin-1聯合APACHEⅡ評分用于評估膿毒癥患者的預后具有更優的預測價值，為今后評估老年膿毒癥病情、研究膿毒癥發病機制提供了新思路、新靶點。但是，本研究的樣本量相對較少，仍需在今后的研究中繼續增加樣本量尋找更優的截點以提高聯合指標的敏感度和特異度。