中性粒細胞胞外捕獲網防御機制的研究進展

謝何昕，魯文賡，司琳清，袁思琦，周繼偉，姚旭東

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163319）

中性粒細胞胞外捕獲網（neutrophil extracellular traps，NETs）是起源于細胞核的非高密度染色質纖維[1]。中性粒細胞（PMN）由于其大部分呈分葉狀核，小部分呈桿狀，又被稱為多形核白細胞。作為最豐富的白細胞類型，PMN在骨髓中發育成熟并釋放到外周血液中，在外周血中循環約6～8 h，在組織中可存活數天。PMN可通過吞噬、脫顆粒和產生NETs對抗入侵的微生物[2-3]。NETs可殺死多種病原體，如細菌、真菌和寄生蟲，同時還可防止微生物擴散。PMN作為主要的抗菌和吞噬細胞，作為先天免疫系統的第一道防線起到重要作用[4]。

PMN能夠迅速到達早期的炎癥感染部位并擊敗微生物病原體，其消滅病原體的機制除了吞噬作用，還包括NETs的產生和釋放。NETs的釋放有兩種主要途徑，分別為：中性粒細胞的炎性死亡方式（NETosis）細胞死亡途徑[1]，其始于核脫孔和核膜的解體，細胞極化喪失、染色質去濃縮和質膜破裂釋放NETs。NETosis細胞非溶解性形式，可以獨立于細胞死亡發生，涉及染色質的分泌排出并伴隨顆粒蛋白脫顆粒釋放NETs。在NETosis最后階段中，其核膜破裂，核染色質進入細胞質[5-6]，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶產生活性氧（ROS），觸發髓過氧化物酶（MPO），MPO刺激中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）從顆粒中易位，NE可促進組蛋白導致質膜通透性增加使NETs釋放到細胞外空間。同時NETs的異常激活也會導致自身免疫損傷等[7],并參與自身免疫等相關疾病。文章針對中性粒細胞的激活和NETs釋放在疾病中的作用展開討論，以期為相關研究及應用提供參考。

1 NETs形成分子機制

NETs可殺死細菌，此過程由NETosis觸發，目前被認為是一種為壞死的獨特程序性死亡，即一種壞死樣的中性粒細胞死亡形式。此外，其非溶解性NETosis可在短時間內釋放NETs[8]。雖然NETosis與NETs密切相關，但并非所有NETs形成均需要細胞死亡過程。根據細胞死亡命名委員會組織規定，術語“NETosis”應該只適用于細胞死亡，而非基于NETs形成的存在[9]。在金葡萄球菌感染期間的PMN檢測到了非溶解性的NETosis，即在非溶解性期間，PMN并未發生死亡。NETosis具有兩種機制：經典或細胞死亡途徑的NETosis以及非溶解性的NETosis。所有形式及過程均極其相似，但其刺激和最終結果均不相同[10]。

細胞死亡途徑的NETosis由各種配體激活TOLL樣受體（TLRs）和補體受體（CRs）觸發，如佛波酯（PMA），其抗體從內質網中釋放Ca的下游信號通路[11]；NETs形成后質膜破裂，導致NETs在數小時內釋放到細胞外空間。非溶解性途徑NETosis是最近被描述的新途徑，依賴革蘭氏陰性菌脂多糖（LPS）刺激[12]，導致caspase-4/11的激活以及GSDMD裂解為GSDMD-P30。其中，GSDMD-P30在核膜、顆粒膜和質膜破裂中起到至關重要的作用。NETosis已經被證明可被特異性分子模式激活，如脂多糖（LPS）、TOLL樣受體（TLRs）、激活血小板和補體蛋白等。

NETosis形成的主要的生物學步驟包括細胞核膜破裂、染色質逐漸去凝固、NE的轉移、組蛋白的加工和合成，最終形成了NETs[13-17]。NETs的形成可通過微生物和內源性刺激促進[18]；同時，NETosis可通過佛波酯（PMA）和白介素8（IL-8）化學刺激物刺激PMN觸發[19]。肖敏[20]研究顯示，PMA刺激中性粒細胞產生大量ROS，進而引起產生NETs；由缺乏NADPH氧化酶的慢性肉芽腫性疾?。╟hronic granulomatous disease，CGD）的患者分離出的中性粒細胞經PMA刺激后無法產生NETs，表明NETs的形成依賴NADPH氧化酶催化生成ROS。肺炎鏈球菌α烯醇化酶（α-enolase）刺激中性粒細胞30 min后即釋放NETs，且此過程不產生ROS。因此，不同誘因誘導PMN產生NETs可能存在不同的分子機制。

2 NETs在宿主防御作用

PMN因微生物的影響將形成NETs，NETosis成為一個防御大型微生物的重要途徑，在不同的NETsosis刺激物中，NETs結構中防御蛋白的數量也不同。

2.1 NETs的抗菌作用

NETs能夠捕獲多種細菌并且防止其傳播。溫麗聯[21]研究發現，NETs的成分包含高濃度抗菌蛋白（組蛋白、彈性蛋白酶等）殺傷病原菌和一些顆粒狀酶，上述成分在細菌細胞膜的分解中起到至關重要的作用。許多微生物，如鏈球菌[22]可通過抑制PMN的激活干擾NETosis，使用某種膜覆蓋自身而逃避NETs。如金葡萄球菌具有一種特殊的酶[23]，可以將NETs介導模式改變為細胞毒性分子，從而根除免疫細胞。

NETs是一把對抗細菌毒性因子的雙刃劍。雖然NETosis可以阻止一些小微生物或含有鞭毛的病原體所引起的感染，但對NETs具有降解因子，從而導致部分含內切酶[24]的病原體引起感染。綜上所述，該過程在特定的條件下發生，主要取決于細菌的性質和細菌毒力因子的產生。白色念珠菌通過與補體受體3（cr3）相互作用[25]，參與了脾臟氨酸激酶（SYK）和蛋白激酶C（PKC）信號通路中NOX的激活。此過程促進了NE的易位、ROS產生和自噬，導致NETosis誘導和NETs的傳播。

2.2 NETs的抗寄生蟲作用

在生物感染寄生蟲的過程中，對宿主防御最重要的是免疫細胞，其中包括先天免疫細胞。以弓形蟲為例，在感染急性期，PMN起到了關鍵的保護作用[26]；弓形蟲感染成纖維細胞，通過非法入侵的方式破壞細胞膜降低原生動物的活力。細胞松弛蛋白作為一種激動劑蛋白，可阻斷寄生蟲入侵細胞[27-29]，以利什曼原蟲傳播為例，PMN通常產生一系列抗菌因子，如一氧化氮、NE和NETs，均具有主要的保護作用[30]。在蠕蟲感染的過程中，免疫防御的主要角色包括先天免疫，對免疫的激活至關重要。寄生蟲的大小剛好可被PMN或者巨噬細胞（macrophages）所吞噬，但蠕蟲體積龐大，無法被吞噬消除[31]。

2.3 NETs的抗病毒作用

雖然目前針對病毒誘導NETs形成機制的相關研究較多，但對NETs抗病毒的免疫尚未完全闡明。NETs的釋放是對病毒引起的感染[32]，主要包括艾滋病病毒（HIV）、呼吸道合胞病毒（RSV）和新型冠狀病毒（SARS-COV-2）。有研究表明，NETs捕獲并且降低了HIV的病毒活性[33]。陸鵬等[34]研究發現，艾滋病嚴重疾病期，患者接受抗病毒治療前后PMN減少癥與發生機會性感染具有一定關系，PMN上TLR7和TLR8識別病毒核酸，進而產生ROS和MPO衍生的氧化劑，形成NETs并消除艾滋病。

由RSV引起最常見的呼吸道疾病通常發展于幼兒和新生兒[35]，RSV對NETs的形成依賴TLR4、MSRK和ERK的激活，最終通過NOX產生ROS。在呼吸道合胞病毒感染期間，PMN被招募到肺部得以控制感染。因此，RSVF蛋白于PMN上的TLR4結合，觸發了NETs的釋放，使整個肺部充滿了NETs，損害組織功能[36]。

3 展望

近年來，隨著NETs的發現，中性粒細胞再次成為研究熱點。中性粒細胞通過NETosis的方式投射細胞外陷阱的機制，中和病原體相關分子模式。NETs由細菌、真菌、病毒和寄生蟲感染所釋放，其釋放受病原體的大小及生物毒力等因素影響，NETs通過其內含的抗菌肽和諸多的酶系統進行捕獲、抑制和殺滅病原微生物。NETs參與了炎癥和多種自身免疫調節疾病的發生發展，但關于NETs的主動調節尚需進一步研究，使之成為一個全新的治療炎癥和自身免疫調節疾病的策略。