腫瘤疾病中MMP2與MMP9作為液體活檢的生物標志物

江鮮雨，裴世敏

（海南大學動物科技學院，海南海口 570100）

細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是一個三維大分子網絡，為鄰近細胞提供生化和結構幫助。ECM不僅能夠調節細胞生長、分化、遷移、存活和內環境穩定等多種生理活動，還與多種疾病的多種病理事件有關。ECM主要由糖蛋白、酶、多糖和水組成，ECM中主要存在的糖蛋白是蛋白多糖、膠原蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白等。膠原蛋白是ECM的主要組成部分，主要存在于動物的結締組織中，是一種纖維糖蛋白。膠原家族由29個（Ⅰ型膠原至ⅩⅩⅨ型膠原）不同的同三聚體或異三聚體多肽分子組成，其中Ⅰ型至Ⅲ型膠原是形成原纖維的膠原，主要負責向間質基質提供拉伸強度；Ⅳ、Ⅶ和ⅩⅩⅧ型膠原主要負責形成類似于基底膜的纖維網狀結構[1]。

基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMPs）家族既能夠參與正常生理過程中細胞外基質的分解，如胚胎發育、生殖和組織重塑；也可參與疾病過程如炎癥反應、腫瘤中血管生成[2-7]。大多數MMPs以非活性蛋白前體的形式分泌，細胞外蛋白酶將其分裂后被激活。MMP2和MMP9屬于基質金屬蛋白酶家族的明膠酶類，為Ⅳ型膠原酶，能夠降解細胞外基質中的明膠成分，參與腫瘤的轉移過程[8]。許多研究證明，發生腫瘤后機體組織中MMP2和MMP9表達異常。有研究發現，MMP9是細胞外基質和基底膜的重要調節因子之一，MMP9的表達會促進上皮細胞的分化和增殖[9]。MMP2在前列腺癌表達中上調，薈萃分析顯示，MMP2豐度越高，癌癥預后越差[10]。在腫瘤組織中，基質金屬蛋白酶已被顯示為腫瘤侵襲和預后的特征性標志[11]。但在犬乳腺癌等腫瘤疾病中，MMP2和MMP9的預后作用尚不明確。

1 MMP2和MMP9的功能

MMP2和MMP9統稱為明膠酶。MMP2被稱為明膠酶A，MMP9被稱為明膠酶B。明膠酶在結構上與MMP家族中的其他蛋白酶相似，但具有一個獨特的膠原結合域。該膠原結合域由催化域N端的3個纖維連接蛋白Ⅱ型串聯重復序列組成，為明膠結合所需[12]。明膠酶通常由成纖維細胞、血管平滑肌細胞和白細胞分泌，MMP2主要由內皮細胞、白細胞、血小板、單核細胞、軟骨細胞、成骨細胞、真皮成纖維細胞和角質形成細胞分泌，而MMP9則由上皮細胞、成纖維細胞、多形核白細胞、粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、T細胞、成骨細胞、樹突狀細胞和角質形成細胞分泌[13]。明膠酶主要消化Ⅳ型膠原和明膠，但也能夠降解其他類型的膠原，如Ⅴ型、Ⅷ型、Ⅹ型、Ⅺ型和ⅪⅤ型膠原[13]。

MMP2分兩個階段分解膠原蛋白：第一階段中MMP2的作用類似于間質膠原酶；第二階段中變性膠原蛋白或明膠在纖維連接蛋白樣結構域的協助下被消化[12-13]。MMP9也主要消化明膠和Ⅳ型膠原。明膠酶可處理多種非膠原ECM蛋白質，如纖維連接蛋白、彈性蛋白、聚集蛋白聚糖、蛋白多糖核心蛋白和巢蛋白等[14]。此外，明膠酶還負責激活其他幾種非基質蛋白，如成纖維細胞生長因子受體1（FGFR1）、胰島素樣生長因子結合蛋白-3和-5（IGF-BP-3和-5）、白細胞介素-1b（IL-1b）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和轉化生長因子-b（TGF-b）[12]。MMP2和其他幾種MMP已被證明可蛋白水解激活TGF-β，促進上皮間質轉化（EMT）。上皮間質轉化不僅與ECM緊密相關，同時也被認為是一個癌癥轉移的關鍵過程[15]。MMP2可在蛋白酶細胞外激活，也可在細胞內激活。MMP2被認為參與多種途徑，包括作用于神經系統以及調節血管化和轉移等。

MMP9的主要功能是降解和重塑細胞外基質的動態平衡。MMP9具有許多作用底物，如Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅶ型、Ⅹ型、Ⅺ型膠原以及蛋白聚糖的核心蛋白、明膠、彈性蛋白等，細胞因子及其受體也是MMP9作用的底物。MMP9是以酶原的形式從胞內分泌到胞外，在體外通過有機汞制劑反應才具有活性，在體內則可經一系列蛋白酶級聯激活。此膠原蛋白結構域可被MMP3、MMP2或次氯酸裂解，而非纖維蛋白溶酶、凝血酶或者MMP1。MMP9能夠分解呼吸道和肺內的結構復合物，如ECM和基底膜,既能夠參與呼吸道和肺的重建，還能夠調節其他蛋白酶及細胞因子的活性，降解α1抗胰蛋白酶，保護中性粒細胞彈性蛋白酶活性,加強膠原質膠體中膠原細胞和MMP13的溶膠原活動，還能夠抑制一些中性粒細胞的趨化因子。此外，MMP9結合CD44可釋放儲存的TGF-β1，MMP9還可通過釋放血管內皮生長因子（VEGF）以參與血管生成[16-17]，血管的生成有利于腫瘤的發展。

腫瘤的轉移過程依賴細胞外基質的降解，MMP2和MMP9可加速細胞外基質的降解，使腫瘤細胞更容易發生轉移。轉移是腫瘤侵襲的重要途徑，大部分惡性腫瘤均具有極強的轉移性。因此，MMP2和MMP9在腫瘤疾病中多呈現上調，能夠加快腫瘤的轉移。MMP2和MMP9與多種腫瘤的發生和發展密切相關，通過調控腫瘤細胞生長、分化、侵襲、調節腫瘤血管生成及免疫監視中發揮重要作用。

2 MMP2和MMP9作為生物標志物

腫瘤的生物標志物具有重要功能，生物標志物可作為腫瘤的預測指標應用于腫瘤的早期發現，如腫瘤普查、篩查，腫瘤的診斷、鑒別診斷與分期，腫瘤患者手術、化療、放療療效監測，腫瘤復發的指標，腫瘤的預后判斷以及尋找不知來源的轉移腫瘤的原發灶。目前，已被發現的腫瘤標志物包括血清癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、前列腺特異抗原（PSA）和絨毛膜促性腺激素（HCG）等。

MMP9不僅能夠促進血管生成，也可增強血管的通透性，導致炎癥相關細胞因子更容易通過血管[18]。Ⅳ型膠原蛋白作為細胞外基質和基底膜的主要成分，在被膠原酶切割后進一步被MMP2和MMP9降解，該過程是腫瘤侵襲和轉移的關鍵環節[12]。研究表明，多種腫瘤組織中，MMP2和MMP9的表達上調參與到腫瘤疾病進展[19]。有研究表明，MMP9表達與胸主動脈瘤的潛在治療靶點相關[20]。抑制MMP9蛋白能夠作為腫瘤治療的靶點，一些靶向和抑制MMP9蛋白的理想先導化學物可應用于透明細胞腎細胞癌的靶向治療[21]。MMP9表達水平升高也與胃癌密切相關[22]。因此，MMP2和MMP9被認為是腫瘤發生過程中潛在的生物標志物，同時也作為細胞外基質重塑的關鍵效應物以及抗腫瘤治療的重要潛在靶點。

腫瘤能夠通過外周血的循環而發生轉移，而腫瘤組織中MMP2和MMP9可能會釋放到外周血中促進腫瘤轉移，成為血液中的腫瘤標志物。血清中MMP2和MMP9的上調極大可能預示著腫瘤的轉移和發展情況。已有研究證表明，循環腫瘤細胞和MMP9之間具有相關性，且二者聯合分析可作為腫瘤轉移和預后的指標[23]。對MMP2和MMP9進行抑制也會抑制腫瘤的發展[24]。

血液系統惡性腫瘤可以定義為影響血液、骨髓和淋巴結的造血細胞不受控制地增殖或擴張[25]。世界衛生組織登記的150多種血液系統惡性腫瘤中有3種主要類型的血液惡性腫瘤或血癌，包括白血病、淋巴瘤和黑色素瘤，均與明膠酶的活性相關[26]。MMP14和低濃度的TIMP-2負責MMP2的激活，而組織蛋白酶G、胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽原、彈性蛋白酶、中性粒細胞彈性蛋白酶和MMP（MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP10、MMP13和MMP26）等酶則負責MMP9的激活。TIMP1與血紅素蛋白酶結構域pro-MMP-9相互作用，保護潛在的MMP9不被其他MMP或酶激活[27-28]。明膠酶的活性越高，對血液系統惡性腫瘤越不利。研究表明，MMP2和MMP9在實體惡性腫瘤中作用廣泛；有報道稱，MMP9的分泌與白血病細胞侵襲增加有關[29]。越來越多的研究表明，明膠酶對血液腫瘤的生長、侵襲和轉移具有重要意義。

3獸醫領域的液體活檢與MMP2和MMP9

在腫瘤性疾病的診斷中，腫瘤標志物（tumor marker，TM）已經成為腫瘤早期診斷的研究熱點之一。除了組織中的腫瘤標志物外，血液中也可能存在腫瘤標志物。研究表明，在犬的淋巴瘤病例中MMP9的活性形式與病例分析指標——有絲分裂指數之間呈正相關[30]。在犬乳腺腫瘤病例中，對25例炎性乳腺癌和15例非炎性乳腺癌腫瘤進行免疫組化染色，發現MMP9在犬炎性乳腺癌中的表達可能導致核多形性增加，但生物學機制有待進一步研究[31]。

研究表明，犬貓骨肉瘤的轉移與MMP2和MMP9的水平和活性有關。大多數犬骨肉瘤中MMP9水平升高，且活性MMP2的值顯著較高[32]。MMP2和MMP9可能會促進犬陰囊內血管瘤的進行性血管生成，并導致腫瘤復發。因此，血清MMP2和MMP9的活性程度可作為預測犬陰囊內血管瘤復發的無創性預后指標；但是通過多變量分析顯示，血清MMP2和MMP9的活性程度不是獨立的預后因素[33]。血清TM需具有一定的特異性,且在不同腫瘤組織中的表達存在較大的差異，方可作為犬腫瘤性疾病的早期診斷依據，使用TM聯合檢測可顯著提高犬惡性腫瘤的檢出率[34]。綜上所述，血液中的MMP2和MMP9可作為潛在的腫瘤檢測標志物，且血液中的TM更便于檢測，TM在犬腫瘤性疾病的診斷中具有較好的輔助診斷作用。隨著更多特異的TM不斷被發現以及檢測技術不斷提高，多項TM的聯合檢測將會在犬腫瘤性疾病診斷的領域中發揮更加重要的作用[35]。

4 結論

近年來，腫瘤性疾病的發生率逐年增高。在犬的腫瘤疾病中，乳腺腫瘤、肥大細胞瘤、黑色素瘤、淋巴瘤等較為常見，具有高轉移性和高致死率。晚期的腫瘤治療相對困難，找到能夠在初期診斷出腫瘤的方法有助于早期的腫瘤治療。同一腫瘤可含有多種TM，而不同腫瘤或同種腫瘤的不同組織類型可含有不同的TM，多項TM聯合檢測可彌補單項TM的不足，提高腫瘤檢出率。在動物腫瘤疾病中，MMP2和MMP9參與炎癥反應，并促進腫瘤的生長、轉移和侵襲。因此，MMP2和MMP9可能作為檢測腫瘤的標志物應用于獸醫臨床。通常檢測腫瘤的方式是細針穿刺抽吸以及組織活檢進行腫瘤標志物的檢測，大多數檢測方法對動物機體具有侵入性，而血液中的腫瘤標志物可作為非侵入性的檢測方法應用于小動物腫瘤的臨床診斷，找到血液中的腫瘤標志物對臨床檢測腫瘤具有重大意義。