探究人參敗毒散對肺炎小鼠干預調控以及線粒體自噬蛋白表達的影響

王 柯，樊建設，樊佳佳，孫力超，楊道文，張洪波*

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.中日友好醫院 中醫肺病科，北京 100029；3.中日友好醫院 急診科，北京 100029）

肺炎是臨床常見疾病，細菌是最常見的致病誘因[1]。隨著醫學的發展，肺炎的研究獲得了長足的進步，但由于抗生素的大量使用，導致獲得性多重耐藥的出現，因此肺炎的病死率仍較高[2]。長久以來，人參敗毒散被廣泛應用于感冒、咳嗽、肺炎等呼吸系統疾病的治療，并取得了較好的療效。其出自于《太平惠民和劑局方》[3]，記載原文為：“治傷寒時氣，頭痛項強，壯熱惡寒，身體煩疼，及寒壅咳嗽，鼻鼾聲重，風痰頭痛，嘔噦寒熱，并皆治之”。而人參敗毒散是通過何種途徑來干預調控肺炎過程以及其是否與自噬通路相關，目前仍尚不明確。本研究旨在揭示人參敗毒散與肺炎的炎癥反應有何相關性，以及自噬在肺炎中的作用，進一步探究人參敗毒散是否能通過調節肺炎小鼠模型的自噬水平以減輕器官損傷。

1 材料與儀器

實驗動物為SPF級別8～10周的ICR雄性小鼠24 只，體重25±2g。飼養條件為6 只/籠。照明條件：明暗交替各12h。動物飼養室：北京中醫藥大學SPF級動物飼養室（溫度23℃，濕度45.4%）。

人參敗毒散，由中日友好醫院中藥房煎制（柴胡9g，前胡9g，川芎6g，枳殼9g，羌活6g，獨活6g，茯苓9g，炒桔梗6g，人參6g，甘草5g，生姜2 片，薄荷2g，濃煎100ml）。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS 和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）均為美國Sigma-Aldrich公司產。

高效組織裂解液（solarbio 公司，中國）；BCA法蛋白定量試劑盒（solarbio 公司，中國）；IL-1β，IL-6，TNF-α 的ELISA 試劑盒（上海森雄，中國）；P62，LC3B，β-actin 抗體（Sigma 公司，美國）；HRP標記二抗（北京中杉金橋有限公司，中國）。

主要儀器設備：電子顯微鏡（日本JEM-1400Plus）；電子天平（諸暨市超澤衡器設備有限公司）；移液器（德國Eppendorf）；舒式切片機（公司：櫻花病理儀器株式會社）；組織包埋機（櫻花病理儀器株式會社，日本）；BIO-RAD 酶標儀（美國產，721BR16681）；BIO-RAD 電泳儀（美國產，042BR03674）；旋轉式組織脫水機（櫻花病理儀器株式會社）；石蠟溶蠟箱（櫻花病理儀器株式會社）；冰凍切片機（LEICA CM 1950）；多功能酶標儀（美國MD公司）。

2 方法

2.1 肺炎小鼠模型建造

通過LPS 誘導的急性肺炎動物模型，已經被廣泛應用于肺炎小鼠模型的構建[4，5]。預實驗我們以10μg/只的LPS 劑量進行肺炎小鼠模型的構建，陰性對照組（Ctrl）小鼠采用同體積的0.9%氯化鈉注射液滴鼻。分別在LPS 處理的3h、6h 和12h 處死小鼠，取其肺臟和肺泡灌洗液進行肺臟組織病理切片、肺臟炎癥因子及肺泡灌洗液炎性細胞的觀察，結果發現隨著LPS處理時間的延長，小鼠肺損傷越來越嚴重，表明我們成功構建了LPS誘導肺炎小鼠模型。

2.2 分組、給藥與取材

采用隨機數字表法，將其平均分為4 個實驗小組，即假手術組（Ctrl）、肺炎模型對照組（NC）、人參敗毒散治療組（Ginseng）和自噬抑制劑干預組（Ginseng+3-MA）。分組給藥見表1。4 個實驗小組均于術后6h處死取材肺臟。

表1 實驗分組及干預措施

3 觀察及檢測指標

3.1 肺組織病理學觀察

取肺部組織，常規進行固定、石蠟包埋、切片以及脫蠟處理，通過HE 染色及脫水，于光鏡下觀察相關組織病理改變。

3.2 酶聯免疫吸附法（ELISA）進行肺泡灌洗液檢測

取出小鼠肺泡灌洗液，按ELISA 試劑盒相關說明，檢測肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6 以及TNF-α含量。

3.3 RNA 提取與細胞因子（IL-1β，IL-6 和TNFα）熒光定量PCR

對取出的肺組織，采用Trizol 法提取總RNA，并檢測總RNA 的濃度。參照RNA 逆轉錄試劑盒說明完成逆轉錄，并合成cDNA。IL-1β 引物序列為上游：CATGGGATAACGAGGCTTATGT，下游：CATATGGACCAGACATCACCAA。IL-6引物序列為上游：CACTCACCTCTTCAGAACGAT；下游：GCTGCTTTCACACATGTTACTC。TNF-α 引物序列為上游：CCAGGGACCTCTCTCTAATCA；下游：TCAGCTTGAGGGTTTGCTAC。β-actin 引物序列為上游：GGACCTGACTGACTACCTCAT；下游：CGTAGCACAGCTTCTCCTTAAT。PCR 擴增程序為：50℃2min；95℃2min；（95℃15s；60℃30s）×40。反應結束后，用儀器自帶軟件分析樣本Ct值，并參照相對定量法進行計算，得出相關mRNA的相對表達量。

3.4 血球計數板法及Wright-Giemsa 染色法觀察肺泡灌洗液炎癥細胞含量

先以血球計數板方法計數白細胞總數，再以Giemsa 染色計數巨噬細胞、中性粒細胞及淋巴細胞的數目。

3.5 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測肺部組織內LC3蛋白表達

低溫剪碎小鼠肺組織，每20mg 組織混入200μl 裂解液。使用勻漿器勻漿，冰上靜置1h 使組織完全裂解。在12000r/min 的條件下，使用高速離心機對配制好的組織勻漿液進行分離，取上清液放入溫度為-80℃的冰箱中冷凍保存。BCA法測定樣本蛋白濃度。根據目標蛋白的分子量制作不同濃度的凝膠，并進行上樣、電泳。采用半干法轉PVDF 膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉2h。根據說明書操作添加一抗，4℃孵育過夜，TBST 洗滌5min，添加二抗，室溫孵育1h，TBST 洗滌5min。在條帶上滴加適量顯色液，用BIO-RAD 凝膠成像儀軟件Image lab 5.2曝光并拍照，分析灰度值。

3.6 統計學方法

應用SPSS26.0 進行統計學分析，將所獲得的實驗數據以均數±標準差來進行對比。多個組別間比較，采用單因素方差相關分析。

4 結果

4.1 各組小鼠肺組織形態

NC 組經過LPS 處理后，在小鼠肺組織細支氣管管壁周邊可以觀察到明顯的炎性細胞浸潤（圖1，見封三）。人參敗毒散（400μl/只）干預后，Ginseng組肺部損傷情況得到明顯減輕（圖1，見封三）。抑制劑組添加3-MA處理后，肺組織的炎性細胞浸潤明顯增多（圖1，見封三）。

圖1 各組小鼠的肺組織（HE×200）

4.2 肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 水平

與LPS 對照組（NC）相比，人參敗毒散干預組的IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 水平明顯下降，具統計學意義（P＜0.01）。自噬抑制劑組中IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 水平較人參敗毒散組明顯提高，具統計學意義（P＜0.01）（圖2A、2B、2C）。

圖2 各組小鼠肺組織中細胞因子的表達水平

4.3 肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白水平

與LPS 對照組（NC）相比，人參敗毒散干預組的IL-1β、IL-6、TNF-α 的蛋白水平明顯下降，具統計學意義（P＜0.01）。自噬抑制劑組中IL-1β、IL-6、TNF-α 的蛋白水平較人參敗毒散組明顯提高，具統計學意義（P＜0.05）（圖2D、2E、2F）。

4.4 肺泡灌洗液炎癥細胞含量

經人參敗毒散處理后，炎癥細胞的數量減少；而經自噬抑制劑3-MA 處理，炎癥細胞數量如白細胞（圖3A）、巨噬細胞（圖3B）、中性粒細胞（圖3C）和淋巴細胞（圖3D）都出現了不同程度的增加（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠的肺泡灌洗液中炎性細胞含量

4.5 肺部組織內LC3蛋白表達

LPS 誘導的小鼠肺炎時，引起肺組織內自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的降低；經人參敗毒散干預后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高（P＜0.01）（圖4、5）。與此同時，使用p62追蹤選擇性自噬過程，結果顯示10μg LPS 處理小鼠6h 后，P62 蛋白水平呈升高趨勢；與肺炎對照組相比，人參敗毒散組P62蛋白水平顯著下降。

圖4 WB蛋白條帶

5 討論

肺炎典型癥狀為發熱、咳嗽、咳痰、痰中帶血、呼吸困難等臨床表現[6，7]，歸屬于中醫“咳嗽”和“肺癰”等病范疇。《中醫內科疾病診療常規》[8]認為本病病因多由風熱疫毒之邪自口鼻而入，首先犯肺，或肺本有伏熱，復感外邪而發。

人參敗毒散不僅是治療虛人外感的經典名方，在我國古代亦被稱為“治疫第一方”[9]，當今多認為肺炎病因與風熱疫毒之邪相關[8]。《素問·評熱病論》中記載：“邪之所湊，其氣必虛”。故方中人參扶助正氣，鼓邪外出，為全方最為精妙之處，《張氏醫通》[10]言其：“全在人參一味，力致開闔，始則鼓舞羌、獨、柴、前各走其經，而與熱毒分解之門，繼而調御津精血氣各守其鄉，以斷邪氣復入之路”；羌活與獨活一上一下，合而驅散一身之邪；柴胡味辛而發散，既有疏散退熱之功，又有升舉陽氣之力；川芎與柴胡配伍，治風兼以調血，正所謂“治風先治血，血行風自滅”；桔梗宣肺開肺，枳殼降氣止咳，升降相依，調暢人體氣機；前胡化痰，茯苓化濕，生姜、薄荷解表散邪，國老益氣和中，調和方中藥性。君臣佐使各守其位，驅邪而不傷正，《增訂葉評傷暑全書》稱其為“調和之宗也”。臨床上，劉立昌[11]應用人參敗毒散治療風咳、感冒等，十分有效；林磊[12]等人在一項關于人參敗毒散與上呼吸道感染的報道指出，人參敗毒散在治療上呼吸道感染方面有重要作用，值得臨床進一步推廣應用；在《新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）經方防治推薦方案（國際第1 版）》[13]中，人參敗毒散被推薦為群體性治療用方。另有報道[13，14]，人參敗毒散及其變方在新冠肺炎的防治上取得較好的療效。

圖5 WB條帶灰度分析

基于現有的文獻報告，自噬被廣泛理解為保守的細胞內的降解途徑，即可通過雙層膜將本身受損的細胞器、錯誤蛋白質以及入侵的病原菌運至溶酶體降解，具有維持胞內微環境穩定的作用[15，16]。LC3 是參與自噬小體形成的主要蛋白，當自噬發生時，胞質型LC3（LC3Ⅰ）被激活，轉變成膜型LC3（LC3Ⅱ）并附著于自噬體膜上，故LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可評估自噬水平的高低[17]。LC3Ⅱ被認為是自噬的生物學標志[18]，其表達水平與自噬呈正相關[19]。p62/SQSTM1 是自噬底物連接蛋白，含有多個結構域，可結合待降解蛋白將其運輸至自噬體中，最終在溶酶體中降解[20]。因此，p62與細胞自噬呈負相關。在肺部的炎癥性疾病發生發展中，自噬反應具有雙重作用，細胞自噬一方面可能有利于病原菌的清除，另一方面，激活的自噬效應能增強肺部的炎癥反應從而加重肺部損傷[21，22]。

本實驗通過鼻腔滴注LPS 建立肺炎小鼠模型，我們發現在LPS（10μg/只）處理6h的小鼠肺組織中自噬相關蛋白LC3 的表達呈輕微降低趨勢，而P62 呈明顯上升趨勢，提示LPS 處理6h 后可抑制自噬的形成。該結果揭露自噬在LPS建立的肺炎小鼠模型中可能有重要調控功能。我們進一步通過肺泡灌洗液測得了炎性細胞數量，結果顯示LPS 處理后炎性細胞的數目明顯增多。原理可能是自噬激活可促進中性粒細胞形成NETs，對外來性細菌發揮清除作用[23]。然而以10μg/只LPS 處理小鼠，極有可能是誘導了小鼠的急性肺損傷，進而造成了自噬的形成受阻，無法清除壞死的肺臟細胞。人參敗毒散干預后，可將受阻的自噬重新激活，從而達到了減輕肺部炎性反應的效果，進而減輕了肺部損傷程度。予以3-MA（自噬抑制劑）處理后，LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值增加，P62 上升，使細胞自噬的程度減弱，肺部損傷的程度加劇。這揭示了自噬在減輕肺部炎癥上具有重要的調節作用。